[发明专利]一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业和动物检疫技术领域，特别涉及一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法。

背景技术

异尖线虫病的病原的确定具有重要的公共卫生学意义，在《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中所分类的可引起人异尖线虫病的主要有6类线虫，即简单异尖线虫、典型异尖线虫、抹香鲸异尖、伪地新线虫、对盲囊线虫和宫脂线虫。在线虫的分类鉴定方法中，形态学鉴定是对异尖线虫进行分类鉴定的传统方法。但是由于鱼体内存在不同发育期的幼虫，其形态、结构存在很大差异，致使目前各属异尖线虫的鉴定存在很大的混乱，依据形态学鉴定，很难将异尖科的线虫和其他种类的线虫进行区分，因此该检测方法并非检测异尖线虫的理想方法，只有通过应用更快捷和特异的方法对异尖线虫的种属进行鉴定。

多重PCR是指在同一PCR反应体系中加入两对或者两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，该技术已经被广泛应用于动物细菌性、病毒性、寄生虫性疾病等的诊断，被公认为是一种方便、快速、敏感、特异的诊断方法。相关研究表明，异尖科线虫核糖体DNA的内转录区(internal transcribed spacer ITS-1、5.8S、ITS-2)序列在线虫进化的过程中显示出种的特异性，在分类鉴定中发挥重要的作用。

在东海海域鱼类感染的异尖科线虫中，感染病原主要以异尖线虫、对盲囊线虫和宫脂线虫的幼虫为主，为了能够准确的鉴别异尖科线虫，该研究建立了异尖科三种线虫的多重PCR检测体系。根据对盲囊线虫、异尖线虫和宫脂线虫的核糖体DNA的内转录区设计特异性的引物，采用多重PCR的方法，对舟山地区被检鱼类的感染虫种进行鉴定，建立异尖科三种线虫的多重PCR检测方法，为鱼类感染异尖科线虫的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。

发明内容

本发明提供一种特异性强、敏感性高的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，该检测方法主要用于对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的检测。

本发明还提供一种用于同时检测对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的引物。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于包括如下步骤：

①对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的虫体DNA提取；

②引物设计与筛选：设计的引物序列为：

对盲囊线虫的特异性引物：

上游引物Contra F:5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3（SEQ ID NO.1），

下游引物Contra R:5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3（SEQ ID NO.2），

异尖线虫的特异性引物：

上游引物Anisk F：5-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3（SEQ ID NO.3），

下游引物Anisk R：5-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3（SEQ ID NO.4），

宫脂线虫的特异性引物：

上游引物Hystero F：5-GGGGCATAGGTGACATACTGG-3（SEQ ID NO.5），

下游引物Hystero R：5-ACCACCAGCAGCACATCACC-3（SEQ ID NO.6），

③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；

④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单重PCR扩增特异性验证；

⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；

⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证。

作为优选，步骤①中虫体DNA提取方法为：将鱼体中采集的线虫样本用蒸馏水洗净后，应用DNA试剂盒进行DNA的提取，将提取的线虫的DNA置-20℃保存备用。

作为优选，步骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μl的PCR反应体系，体系包含5U/μl的Taq聚合酶0.5μl、10×PCR Buffer2.5μl、10mM dNTP1.6μl、模板DNA2μl、工作浓度为20μM的引物0.4μl；退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃退火温度梯度试验，根据实际PCR反应结果，确定最佳的退火温度；引物浓度的调整：初次三种线虫采用相同的引物浓度，根据反应的结果，进行各引物浓度的调整，确定最佳的浓度。