[发明专利]一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于包括如下步骤：

①对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的虫体DNA提取；

②引物设计与筛选：设计的引物序列为：

对盲囊线虫的特异性引物：   

上游引物 Contra F: 5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3（SEQ ID NO.1），

下游引物 Contra R: 5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3（SEQ ID NO.2），

异尖线虫的特异性引物：

上游引物 Anisk F：5- CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3（SEQ ID NO.3），

下游引物 Anisk R：5- CCCTACGAAATGGCATACTTG-3（SEQ ID NO.4），

宫脂线虫的特异性引物：

上游引物 Hystero F：5- GGGGCATAGGTGACATACTGG-3（SEQ ID NO.5），

下游引物 Hystero R：5- ACCACCAGCAGCACATCACC-3（SEQ ID NO.6），

③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；

④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单重PCR扩增特异性验证；

⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；

⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证。

2.根据权利要求1所述的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，其特征在于：步骤①中虫体DNA提取方法为：将鱼体中采集的线虫样本用蒸馏水洗净后，应用DNA 试剂盒进行DNA的提取，将提取的线虫的DNA置-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，其特征在于：步骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μl的PCR反应体系，体系包含5U/μl的 Taq聚合酶0.5μl、10×PCR Buffer 2.5μl、10mM dNTP  1.6μl、模板DNA 2μl、工作浓度为20μM的引物0.4μl；退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃退火温度梯度试验，根据实际PCR反应结果，确定最佳的退火温度；引物浓度的调整：初次三种线虫采用相同的引物浓度，根据反应的结果，进行各引物浓度的调整，确定最佳的浓度。

4.根据权利要求1所述的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，其特征在于：步骤③中，所述的最佳多重PCR反应条件为： 25μl的PCR反应体系，体系包含5U/μl的 Taq聚合酶0.5μl、10×PCR Buffer 2.5μl、10mM dNTP 各1.6μl、20μM的对盲囊线虫上下游引物各0.8μl、简单异尖线虫上下游引物各0.4μl、宫脂线虫上下游引物各0.4μl、三种线虫模板DNA 2μl，加蒸馏水至25μl，多重PCR检测扩增程序：94℃ 5min→94℃ 30sec，55.0℃ 30sec，72℃1min，30个循环→72℃ 10min。

5.用于同时检测对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的引物，其特征在于其序列为：

对盲囊线虫的特异性引物：   

上游引物 Contra F: 5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3（SEQ ID NO.1），

下游引物 Contra R: 5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3（SEQ ID NO.2），

异尖线虫的特异性引物：

上游引物 Anisk F：5- CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3（SEQ ID NO.3），

下游引物 Anisk R：5- CCCTACGAAATGGCATACTTG-3（SEQ ID NO.4），

宫脂线虫的特异性引物：

上游引物 Hystero F：5- GGGGCATAGGTGACATACTGG-3（SEQ ID NO.5），

下游引物 Hystero R：5- ACCACCAGCAGCACATCACC-3（SEQ ID NO.6）。