[发明专利]一种野生型rhNGF的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及野生型rhNGF的制备方法。

背景技术

自上世纪70年代以来，大肠杆菌原核表达系统一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。作为外源基因表达的宿主，大肠杆菌遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞，并且近年来出现了很多新型的真核表达系统，但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来，有关蛋白结构以及功能研究的开展，对基因表达的要求更高，这时原核表达往往是表达的第一选择。

众所周知，原核表达存在两个缺点：第一，容易形成包涵体；第二，大多数的重组表达方案都会在重组蛋白的上游的引入多余的氨基酸残基。无法获得可溶性的、天然无多余氨基酸残留的野生型目的蛋白。目前需要一种解决以上问题的蛋白制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够产业化生产野生型hNGF的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，

1）hNGF片段获取：

PCR扩增：上游引物5’端引入XmnI酶切识别位点序列GAAGGAGTTC，下游引物引入多克隆位点上其他任意酶切识别位点，同时下游引物的反义链3’端必须带有终止密码子；利用该对引物扩增β-hNGF成熟肽编码序列；或

通过人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的编码碱基进行扩增；

2）酶切：分别双酶切PCR产物和载体并回收；所述载体带有类似XmnI酶切识别位点或表达产物可被Factor Xa的内切酶酶切的载体；

3）连接：T4连接酶连接载体和双酶切后的PCR产物，转化大肠杆菌表达菌株并进行鉴定；

4）诱导表达：IPTG诱导表达；

5）亲和层析纯化：麦芽糖蛋白亲和层析纯化获得MBP-NGF重组蛋白；

6）获得野生型β-hNGF：Factor Xa或肠激酶或Genenase I切除MBP标签蛋白，获得野生型β-hNGF。

所述1）步骤中的PCR扩增，上游引物序列为SEQ ID NO:1，下游引物序列为SEQ ID NO:2，下游引物带HindIII酶切位点。

所述2）酶切中，所述载体为pMAL-c2X，pMAL-p2X，pMAL-c2E,pMAL-p2E,pMAL-c2G,pMAL-p2G,pGEX-4T-1或pGEX-4T-2。

所述5）亲和层析纯化为：

（1）低温离心收集目的蛋白表达菌体；

（2）用Resuspending Buffer重悬菌体，在冰水浴中进行超声波破碎，所述Resuspending Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl₂;1mM DTT；pH6.5；

（3）低温离心，缓慢吸取上清液，滤膜过滤后移至新离心管中，置冰上待纯化；

（4）不溶物再用Resuspending Buffer重悬，重复以上步骤进行超声处理；离心获取上清液，沉淀可再进行超声破碎或进行再次重复；

（5）重力柱纯化或者蛋白纯化：

所用的填料为Dextrin Sepharose HP，

轻柔、充分翻转摇匀填料悬浊液，用宽嘴枪头吸取树脂浆，待树脂完全沉降，打开层析柱下方旋钮，当储存缓冲液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下时，用5倍树脂体积的ddH₂O洗树脂，然后再用5倍树脂体积Binding Buffer平衡树脂；

待Binding Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液;将流速控制在每小时10倍柱体积;重复吸附一次，收集穿过组分并置于冰上；

用5倍树脂体积Binding Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上；

用8倍树脂体积Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分置于冰上；

所述收集穿过组分即为纯化后的MBP-NGF重组蛋白；