[发明专利]一种野生型rhNGF的制备方法

权利要求书

1.一种野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，

1）hNGF片段获取：

PCR扩增：上游引物5’端引入XmnI酶切识别位点序列GAAGGAGTTC，下游引物引入多克隆位点上其他任意酶切识别位点，同时下游引物的反义链3’端必须带有终止密码子；利用该对引物扩增β-hNGF成熟肽编码序列；或

通过人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的编码碱基进行扩增；

2）酶切：分别双酶切PCR产物和载体并回收；所述载体带有类似XmnI酶切识别位点或表达产物可被Factor Xa的内切酶酶切的载体；

3）连接：T4连接酶连接载体和双酶切后的PCR产物，转化大肠杆菌表达菌株并进行鉴定；

4）诱导表达：IPTG诱导表达；

5）亲和层析纯化：麦芽糖蛋白亲和层析纯化获得MBP-NGF重组蛋白；

6）获得野生型β-hNGF：Factor Xa或肠激酶或Genenase I切除MBP标签蛋白，获得野生型β-hNGF。

2.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述1）步骤中的PCR扩增，上游引物序列为SEQ ID NO:1，下游引物序列为SEQ ID NO:2，下游引物带HindIII酶切位点。

3.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述2）酶切中，所述载体为pMAL-c2X，pMAL-p2X，pMAL-c2E,pMAL-p2E,pMAL-c2G,pMAL-p2G,pGEX-4T-1或pGEX-4T-2。

4.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述5）亲和层析纯化为：

（1）低温离心收集目的蛋白表达菌体；

（2）用Resuspending Buffer重悬菌体，在冰水浴中进行超声波破碎，所述Resuspending Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl₂;1mM DTT；pH6.5；

（3）低温离心，缓慢吸取上清液，滤膜过滤后移至新离心管中，置冰上待纯化；

（4）不溶物再用Resuspending Buffer重悬，重复以上步骤进行超声处理；离心获取上清液，沉淀可再进行超声破碎或进行再次重复；

（5）重力柱纯化或者蛋白纯化：

所用的填料为Dextrin Sepharose HP，

轻柔、充分翻转摇匀填料悬浊液，用宽嘴枪头吸取树脂浆，待树脂完全沉降，打开层析柱下方旋钮，当储存缓冲液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下时，用5倍树脂体积的ddH₂O洗树脂，然后再用5倍树脂体积Binding Buffer平衡树脂；

待Binding Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液;将流速控制在每小时10倍柱体积;重复吸附一次，收集穿过组分并置于冰上；

用5倍树脂体积Binding Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上；

用8倍树脂体积Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分置于冰上；

所述收集穿过组分即为纯化后的MBP-NGF重组蛋白；

所述Binding Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl₂;pH6.5、Elution Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl₂;10mM Maltose；pH6.5；均用ddH₂O配置Binding Buffer、Elution Buffer，0.22μm过滤器过滤除菌。