[发明专利]鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记及其专用引物。具体涉及多年生黑麦草的特异分子标记及其鉴定方法。

背景技术

多年生黑麦草（Lolium perenne）具有生长快，分蘖多，繁殖能力强，是世界温带地区最重要的优良牧草之一，越冬越夏能力较高（2002，于应文）。多花黑麦草（L.multiflorum）属于一年生牧草，具有生长快速，产草量高，饲用品质优，适牧性好。可作为高寒牧区建植一年生刈牧兼用型人工草地的优良草种（2004，张卫国），但其生育周期只有一年。而这两种牧草的种子、幼苗、叶片和干草在外观形态上极其相似（图1），分辨十分困难，极易造成不可挽回的损失，而现在国内外还没有一个统一的、行之有效的鉴定方法。

因而准确迅速区分多年生黑麦草和多花黑麦草种子，对于提高我国黑麦草种子的利用具有十分重要的意义。

准确迅速区分多年生黑麦草和多花黑麦草种子是鉴别黑麦草种子中的一大难题。前人对两种牧草种子的鉴定技术进行了很多尝试性的研究，并取得了一定的成就，可将这些方法归纳为二类：一是根据种子气味、形态和色泽等形态学特征进行区分。但是由于两个草种的种子外形和颜色十分相似，不易区分，特别是在成熟度不一致以及环境、气候等因素的影响而造成种子形态不规则的情况下，鉴定工作的难度则更大，鉴定结果具有一定的主观性；二是田间鉴定，这种方法是将种子播种于试验田，待出苗后每隔7～10d观察一次，最后鉴定出多年生黑麦草和多花黑麦草。此种方法最终能鉴定出多年生黑麦草和多花黑麦草，但是由于这两种牧草分别是多年生和一年生植物，苗期差异不明显，所以该方法具有成本高、周期长和效率低等不足，极易造成大量经济损失。

发明内容

本发明的目的一是避免现有检测技术的不足，提出一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记引物。

本发明的目的二是提供一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒。

本发明的目的三是提供一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记方法。

以便快速、高效和准确的鉴定多年生黑麦草种子的真伪。此方法省时省力，操作简便，在实验室条件下较短时间内能够很好的完成。研究中，随机选取的10个黑麦草种质都可适用，具有很强的推广价值，有助于种子检验人员对多年生黑麦草种子和多花黑麦草种子的区分，使黑麦草更好的为畜牧业生产服务，为保障我国的粮食安全打下坚实的基础。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记引物，其主要特点是包括有：

黑麦草专用引物：Lolium-F（5′-3′）：TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC，

Lolium-R（5′-3′）：CTTTGATCCGCATATGTTTGG。

一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒，其主要特点是包括有：

多年生黑麦草PCR检测体系的总体积为，其中包括2×PCR Master（20mM MgCl₂，2.5mM dNTP，2.5U/μl Taq和2×PCR Buffer），引物Lolium-F（5′-3′）：TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC，引物Lolium-R（5′-3′）：CTTTGATCCGCATATGTTTGG，ddH₂O；

一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记方法，其主要特点是包括如下步骤：

A.采集种子，采用双层滤纸萌发法，20～30℃萌发72h，提取萌发种子基因组DNA备用；

B.利用黑麦草专用引物，对多年生黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系总体积为20μl，其中包括2×PCR Master（20mM MgCl₂，2.5mM dNTP，2.5U/μl Taq和2×PCR Buffer）10μl，DNA模板，浓度为200ng/μl，1μl，引物Lolium-F（5′-3′）：TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC1μl，引物Lolium-R（5′-3′）：CTTTGATCCGCATATGTTTGG1μl，ddH₂O7μl；

扩增条件为：（1）94℃预变性3min；（2）94℃变性35s；（3）54℃退火35s；（4）72℃延伸35s；（5）2～4步骤循环38次；（6）72℃延伸7min；