[发明专利]鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记引物，其特征是包括有： 

黑麦草专用引物：Lolium-F（5′-3′）：TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC， 

Lolium-R（5′-3′）：CTTTGATCCGCATATGTTTGG。 

2.一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒，其特征是包括有：多年生黑麦草PCR检测体系，其中包括2×PCR Master，20mM MgCl₂，2.5mM dNTP，2.5U/μl Taq和2×PCR Buffer，引物Lolium-F（5′-3′）：TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC，引物Lolium-R（5′-3′）：CTTTGATCCGCATATGTTTGG，ddH₂O。 

3.一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记方法，其特征是包括如下步骤： 

A.收集种子，采用双层滤纸萌发法，20℃～30℃萌发72h，提取萌发种子基因组DNA备用； 

B.利用黑麦草专用引物，对多年生黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测，PCR检测体系总体积为20μl，其中包括2×PCR Master（20mM MgCl₂，2.5mM dNTP，2.5U/μl Taq和2×PCR Buffer）10μl，DNA模板，浓度为200ng/μl，1μl，引物Lolium-F（5′-3′）：TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC1μl，引物Lolium-R（5′-3′）：CTTTGATCCGCATATGTTTGG1μl，ddH₂O7μl；扩增条件为：（1）94℃预变性3min；（2）94℃变性35s；（3）54℃退火35s；（4）72℃延伸35s；（5）2～4步骤循环38次；（6）72℃延伸7min； 

C.利用黑麦草专用引物，对多花黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测，PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×PCR Master（20mM MgCl₂，2.5mM dNTP，2.5U/μl Taq和2×PCR Buffer）10μl，DNA模板，浓度为200ng/μl，1μl，引物Lolium-F（5′-3′）：TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC1μl，引物Lolium-R（5′-3′）：CTTTGATCCGCATATGTTTGG1μl，ddH₂O7μl；扩增条件为：（1）94℃预变性3min；（2）94℃变性35s；（3）54℃退火35s；（4）72℃延伸35s；（5）2～4步骤循环38次；（6）72℃延伸7min。 

D.PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测； 

E.其电泳扩增条带多年生黑麦草176bp，多花黑麦草156bp。