[发明专利]转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因作物中cry2Ab基因的引物组、试剂盒和检测方法。 

背景技术

根据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计，2012年全球转基因作物种植面积达到1.703亿公顷，比1996年增长了100倍，这一增速使得转基因技术成为现代农业史上应用最为迅速的作物技术。目前种植的转基因作物种类主要包括大豆、玉米、棉花、油菜、番茄、番木瓜、甜菜、苜蓿等，目标性状主要为抗虫、抗除草剂或抗虫抗除草剂复合性状。已商业化的抗虫转基因作物的目的基因主要有cry1Ac、cry1Ab、cry1A.105、cry2Ab、cry3A、cry3Bb等，其中转cry2Ab基因作物包括转基因玉米MON89034、转基因棉花MON15985等，在抗虫转基因作物中所占的比例较大。 

与转基因作物产业化的蓬勃发展相对应的，是社会公众对其安全性的持续担忧。为此，许多国家和地区制订了转基因生物标识管理制度，我国自2001年相继颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物标识管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》、《农业转基因生物加工审批办法》等一系列配套管理办法，对转基因生物进行全产业链监管，并对转基因玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等5类17种转基因作物及其产品实施强制性标识管理制度。 

转基因生物安全管理制度的执行必须依赖于转基因生物及其产品检测技术。目前转基因作物的检测技术主要分为两大类：一类以转入的外源DNA为检测对象，如PCR、Southern杂交、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、Western杂交、免疫试纸条等。其中PCR方法应用最为广泛，可细分为定性PCR、复合PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等。然而，由于PCR方法需要PCR仪等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长（约3~4 h），很难实现现场检测，因此，实际工作中还需要一种便捷、准确、且适用于现场操作的转基因作物检测新技术。 

LAMP技术是由日本荣研化学株式会社于2000年开发的一种新的基因扩增方法，该方法的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1 h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。 

LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因作物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因作物中cry2Ab基因的检测方法和试剂盒。 

发明内容

本发明的目的在于公开一种转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组。 

本发明的另一个目的在于公开一种转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，以便于对cry2Ab基因进行LAMP检测。 

本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测方法，其具有特异性强、灵敏度高、操作简便、结果可靠等特点。 

本发明所采用的技术方案如下： 

根据cry2Ab基因的核苷酸序列，设计合成cry2Ab基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~6；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性、灵敏度进行验证。

一种cry2Ab基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物1、环引物2，其核苷酸序列分别如下所示： 

外引物1：ACTGTTCCTC AACCGCTTG（SEQ ID NO：1）；

外引物2：GGAGTAGTCC CTGGTGTAGT（SEQ ID NO：2）；

内引物1：AGGAGAGGTG CAGGTTGGCA CTCAGTTCCA GATGCAAGGC（SEQ ID NO：3）；