[发明专利]转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2、环引物1和环引物2，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：ACTGTTCCTC AACCGCTTG（SEQ ID NO：1）；

外引物2：GGAGTAGTCC CTGGTGTAGT（SEQ ID NO：2）；

内引物1：AGGAGAGGTG CAGGTTGGCA CTCAGTTCCA GATGCAAGGC（SEQ ID NO：3）；

内引物2：GACGTGATCC TCAACGCTGA CGTCTTCAGG TAGTCGCGGT AG（SEQ ID NO：4）；

环引物1：CTGAGCAAAG AGTGGCAGCA（SEQ ID NO：5）；

环引物2：GGGCATCTCT GCAGCCA（SEQ ID NO：6）。

2.转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）引物溶液：由权利要求1所述的6条引物配制的混合溶液，引物的浓度依次为4~6 μmol/L、4~6 μmol/L、32~48 μmol/L、32~48 μmol/L、16~24 μmol/L、16~24 μmol/L；

（2）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9 U/μL；

（3）10×反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH₄)₂SO₄，20~80 mmol/L MgSO₄，6~14 mol/L甜菜碱；

（4）dNTPs溶液：由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

（5）阳性DNA对照样品：转cry2Ab基因作物的基因组DNA，或含有cry2Ab基因的大肠杆菌质粒DNA；

（6）阴性DNA对照样品：不含cry2Ab基因序列的DNA。

3.根据权利要求2所述的cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的引物溶液中含有5 μmol/L外引物1、5 μmol/L外引物2、40 μmol/L内引物1、40 μmol/L内引物1、20 μmol/L环引物1、20 μmol/L环引物2。

4.根据权利要求2所述的cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μL。

5.根据权利要求2所述的cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的10×反应缓冲液中MgSO₄、甜菜碱的浓度分别为40 mmol/L、8 mol/L。

6.利用权利要求2~5任一项所述的试剂盒检测转基因组作物中cry2Ab基因的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入DNA模板2~5 μL、引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液4 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；

（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将DNA模板分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；

（4）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（5）LAMP扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果、或取1~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

7.根据权利要求2~5任一项所述的转cry2Ab基因作物的LAMP检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括显色剂，所述显色剂为SYBR GREEN I荧光染料。

8.利用权利要求7所述的试剂盒检测转cry2Ab基因作物的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入DNA模板2~5 μL、引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液4 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；

（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将DNA模板分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；

（4）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（5）LAMP扩增结果的鉴定：在反应管中加入1~2 μL 显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。