[发明专利]一种去除病毒裂解疫苗中裂解剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种去除病毒裂解疫苗中裂解剂的方法。

背景技术

迄今流感疫苗产品主要是流感全病毒疫苗和流感裂解疫苗。流感裂解疫苗由于具有更强的免疫原性及更多的适宜接种人群而成为主要上市产品和新的研究热点。在裂解疫苗的生产工艺中，需要加入合适浓度的裂解剂对病毒原液进行裂解处理,再去除裂解剂，得到病毒裂解疫苗。国内外常用的裂解剂有吐温80、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）等。病毒裂解程度和裂解剂的去除程度与疫苗使用的安全性及不良反应息息相关，裂解剂的残余含量是流感病毒裂解疫苗的主要质控指标之一。

目前流感疫苗生产工艺中，裂解剂的去除普遍采用超滤法和透析法。超滤法采用封闭系统，超滤膜可重复多次使用，超滤过程中还可带走样品中部分热源质，有效控制细菌内毒素，有操作方便，易于批量生产等优点。但超滤膜对抗原有吸附作用，在生产过程中损失一定数量的抗原，造成浪费，成本增加。而透析法生产用时间周期较长，费时费力，不易操作和工业放大，且使病毒原液增大体积，稀释了血凝素的含量，常会使血凝素含量指标达不到规程要求，还需将病毒液浓缩后才可作为疫苗原液使用。这样既增加纯化成本，又增加了疫苗原液被污染的机会。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种去除病毒裂解液中裂解剂的方法。

本发明所提供的去除病毒裂解液中裂解剂的方法，包括如下步骤：用裂解剂对病毒原液进行裂解，得到病毒裂解液；以十八碳烷基硅烷键合硅胶为固定相，将病毒裂解液进行固相提取，去除病毒裂解液中的裂解剂。

上述方法中，所述固相提取的方法包括如下步骤：将所述病毒裂解液流经所述固定相，收集流穿峰，得到去除裂解剂的疫苗。该过程中，目标物质与所述固相不结合，存在于流穿液中；裂解剂与固定相结合。

上述任一方法中，所述流经的线性流速为0.75cm/min。

上述任一方法中，所述流经的压力为0.1-0.4bar。

上述任一方法中，所述病毒裂解液与所述固定相的比为：2000ml病毒裂解液：100ml固定相。

上述任一方法中，所述收集流穿峰为收集AU值大于等于0.06AU的流穿峰。

所述收集过程中使用紫外检测仪监测280nm的紫外峰吸收。

上述任一方法中，在所述收集流穿峰之后，包括如下淋洗收集步骤：

用溶液C对上样后的固定相进行洗脱，溶液C与固定相的配比为200ml溶液C：100ml固定相；

所述溶液C为磷酸盐缓冲生理氯化钠溶液，pH值为7.2；

当峰值下降至0.06AU时，停止收集。

上述任一方法中，在所述流经前，包括如下固定相活化步骤：

将溶液A和溶液B依次通过所述固定相；

所述溶液A与所述固定相的配比为：200ml溶液A：100ml固定相；

所述溶液B与所述固定相的配比为：300ml溶液B：100ml固定相。

所述溶液A为75%乙醇水溶液，pH值为6.8；

所述溶液B为磷酸盐缓冲生理氯化钠溶液，pH值为7.2。

上述任一方法中，所述病毒原液中的蛋白含量为500-1500ug/ml。

上述任一方法中，所述病毒为流感病毒；所述裂解剂为Triton X-100。

上述任一方法中，裂解剂在病毒原液中的浓度可为0.5%（体积百分含量）。

实验证明，本发明方法去除疫苗中裂解剂的效果明显好于超滤法，去除率可达96%，且去除效果非常稳定，同时，疫苗的有效成分的回收效率高，可达90%。此外，十八碳烷基键合硅胶的Triton X-100最大负载量高达154g/L，同时对裂解液蛋白质含量适用范围较宽，Triton X-100结合在凝胶上，目标蛋白在流穿峰中，单批次处理量大，操作简单，非常适宜于规模化生产，且凝胶可再生，生产成本较低。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、去除流感病毒裂解疫苗中裂解剂的方法

一、流感病毒裂解疫苗的来源

本发明方法中使用的流感病毒裂解疫苗可为市售的流感病毒裂解疫苗，取其生产过程中全病毒液，全病毒液蛋白浓度在500-1500ug/ml之间即可，裂解过程使用裂解剂为聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）。

本实施例中使用的流感病毒裂解疫苗是按照如下方法制备的：