[发明专利]一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于地中海贫血检测技术领域，涉及一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

α-地中海贫血是一种染色体隐性混乱的遗传性疾病，它的特征主要有血红细胞和血红蛋白缺乏引起的贫血，并且临床症状也从无症状转变为致死性溶血性贫血。现在被大多数有资质进行α-地中海贫血检测的医院使用的是Gap-PCR法，此方法需要操作人员十分熟悉普通PCR反应全过程，因为每一个步骤对结果的影响都非常大，故对临床遗传专业人员的实验操作水平要求很高。并且实验过程中致癌物质（EB）的污染问题、得到实验结果的时效性问题（约2～4天）以及昂贵的检测费用等问题都制约着该项疾病的安全有效诊断。

DNA的检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

国内成熟产品中，外周血中核酸的提取，目前主要有三种方法：

（1）直接煮沸法：向外周血中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板。其优点是易于操作；缺点是不能有效去除外周血中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增。

（2）浓缩煮沸法：先将外周血浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，这种方法是目前国内临床通用的方法，其优点是能部分去除“直接煮沸法”中无法去除的抑制性因素；缺点是不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到。看得到沉淀的是因为将核酸与蛋白都浓缩了，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的，使操作者无法确定吸弃杂质时会不会把核酸一起吸弃，而导致核酸损失，导致成为假阴性。

（3）柱提取法：外周血通过裂解，过柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板。这种方法相对前两种提取方法而言，提取的核酸纯度大大提高，不但可用于下游PCR实验，还可用来做其他分子生物学实验。

临床上检测α-地中海贫血缺失类型的方法目前主要是基于现在被大多数有资质进行α-地中海贫血检测的医院使用的是Gap-PCR法，国内已有多种基于Gap-PCR法用于α-地中海贫血缺失类型检测的试剂盒，但尚无实时荧光定量PCR技术（染料法）检测α-地中海贫血的试剂盒应用于临床检测中。已有的这些试剂盒所提供的α-地中海贫血提取方法有很多不足之处：1）核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，需要经过多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本丢失验证，核酸提取效率低；2）检测灵敏度低，约在其实模板样本量达到5000copies/ml左右；3）一般没有预防PCR产物污染的措施；4）没有荧光归一化校正系统，结果判定受主观因素影响较大。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种操作简便、耗时短、高效且安全可靠的α-地中海贫血缺失型检测技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测SEA、4.2和3.7型缺失的染料、用于扩增SEA、4.2和3.7型缺失的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和酶混合液。该试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测，可以确定外周血样本中α-地中海贫血的缺失类型，可为灵敏、早期诊断α-地中海贫血缺失类型提供可靠的实验证据。

为此，本发明一方面提供了一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，其包括3种PCR反应液，所述3种PCR反应液中均含有用于靶多核苷酸扩增的引物，其中，

PCR反应液Ⅰ含有源于人基因组16号染色体α1和α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血SEA缺失的引物，且所述引物的序列为，

上游引物α-SEA-F：5’-TCAGCCACCCGCAGACCAAGACCTA-3’；

下游引物α-SEA-R：5’-AGACAGCGTCACCCTCAGAGCCAT-3’

PCR反应液Ⅱ含有源于人基因组16号染色体α1基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血3.7缺失的引物，且所述引物的序列为，

上游引物α-3.7-F：5’-GGGGTGTCACAGTGAACCACGACC-3’；

下游引物α-3.7-R：5’-GCCCCTGCCTTTTCCTACCCTATCC-3’；

PCR反应液Ⅲ含有源于人基因组16号染色体α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血4.2缺失的引物，且所述引物的序列为，