[发明专利]一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒，其包括3种PCR反应液，所述3种PCR反应液中均含有用于靶多核苷酸扩增的引物，其中，

PCR反应液Ⅰ：含有源于人基因组16号染色体α1和α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血SEA缺失的引物，且所述引物的序列为，

上游引物α-SEA-F：5’-TCAGCCACCCGCAGACCAAGACCTA-3’；

下游引物α-SEA-R：5’-AGACAGCGTCACCCTCAGAGCCAT-3’

PCR反应液Ⅱ：含有源于人基因组16号染色体α1基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血3.7缺失的引物，且所述引物的序列为，

上游引物α-3.7-F：5’-GGGGTGTCACAGTGAACCACGACC-3’；

下游引物α-3.7-R：5’-GCCCCTGCCTTTTCCTACCCTATCC-3’；

PCR反应液Ⅲ：含有源于人基因组16号染色体α2基因的保守区域的用于检测α-地中海贫血4.2缺失的引物，且所述引物的序列为，

上游引物α-4.2-F：5’-GGCAGCCTTGGGCAACCTGTCTAC-3’；

下游引物α-4.2-R：5’-GGGCGGCTCCAGATTCAGACTCCT-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述3种PCR反应液中均含有SYBR GREEN染料、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、脱氧尿嘧啶核苷三磷酸及参比染料。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每种所述PCR反应液中含SYBR GREEN I染料、10×PCR反应缓冲液、0.1～0.4mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸、0.1～0.4mmol/L脱氧尿嘧啶核苷三磷酸、40～200mmol/L参比染料以及0.2μmol/L～0.4μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液和α-地中海贫血阴性对照。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包含浓度为1～5U/μl的耐热DNA聚合酶和浓度为0.05～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液、蛋白酶K溶液、吸附柱、漂洗液、缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ。

7.一种使用如权利要求1～6中任意一项所述的试剂盒进行α-地中海贫血荧光定量PCR检测的方法，其包括：

步骤K，将3种PCR反应液分别与酶混合液混合后制成3种PCR混合液；

步骤L，将3种PCR混合液离心处理，然后将经过离心处理的3种PCR混合液分别加入3组反应管，并分别向含有PCR混合液的各反应管中加入α-地中海贫血阴性对照和待测样品核酸，制成PCR反应样品，盖好管盖；

步骤M，将各反应管置于荧光定量PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；

步骤N，根据样品的扩增曲线形状、扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值进行α-地中海贫血缺失分析；

其中，在步骤K中，PCR反应液的加入量为42～43μl/人份，酶混合液的加入量为1～2μl/人份。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤L中，每个反应管中总液体加入量为50μl，待测样本核酸或α-地中海贫血阴性对照的加入量为3～5μl。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在步骤N中，如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值，且Ct值≥36，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示或无定值结果显示，则判为阴性。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提取核酸的操作，其包括，

步骤A，裂解红细胞及蛋白；

步骤B，去除杂质；

步骤C，洗涤；

步骤D，洗脱。