[发明专利]适于转化细胞的构建体、系统及其应用

说明书

提供了适于转化细胞的构建体、系统及其应用，其中一种适于转化细胞的构建体包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因。将该适于转化细胞的构建体与本发明的包含附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中tracrRNA序列与crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框的另一种适于转化细胞的构建体配合使用，即利用这两种构建体共转染细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及适于转化细胞的构建体、系统及其应用，更具体地，涉及两种配合使用的适于转化细胞的构建体、适于转化细胞的系统、转化细胞的方法以及重组细胞。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR）系统是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，CRISPR含有一个与病毒或质粒同源的短重复序列，通过对外来同源的DNA作用影响病毒或质粒的复制，是原核生物的免疫系统一部分。CRISPR重复间隔阵列可以被转录成一个长的初级转录本，由于该序列包含多个重复片段，可形成多个发夹结构的二级结构，随后被加工成一个个短的CRISPR RNAs，这些RNA序列包含一段保守的重复片段和一段与外源DNA互补的可变间隔序列，也叫引导序列（guide sequence）。在CRISPR位点附近,存在一系列CRISPR相关基因(CRISPR-associated,Cas)，crRNAs可以和Cas蛋白结合，将Cas蛋白引导到靶序列周围，诱导双链切割功能，形成DNA双链断裂。依据核心元件组成和序列的差异，可以将CRISPR/Cas系统分成3类。第I型和第III型CRISPR系统，涉及到多个亚基复合体参与crRNA识别和双链切割。相比而言，第II型CRISPR系统仅包含单一的Cas9蛋白，参与crRNA介导的外源双链切割。

在II型CRISPR系统中，crRNA可以通过碱基对来连接反式活性的RNA（tracr-RNA）来形成复合RNA结构。这种复合RNA结构分子可以指导Cas9蛋白质来在特定位点引入双链DNA的断裂。而Cas9可以结合tracrRNA：crRNA复合物反过来通过指导其来结合至DNA序列上发挥作用。在这个Cas9–crRNA复合物行使功能的过程中，短间区序列邻近基序（protospacer-adjacent motif，PAM)起着识别敌我的作用，在靶序列的周围具有一些短特征序列，如NGG结构，是CAS9行使功能的重要前提。此外，tracrRNA：crRNA复合体可以通过序列融合，形成融合转录本，且可以被Cas9高效识别，这类融合RNA也叫引导RNA（guide RNA，gRNAs）。因此，Cas9-gRNA系统中，包含与靶序列完全互补的20个碱基的gRNA介导特异性识别，而Cas9的2个截然不同的活性位点(RuvC and HNH)行使位点特异性切割功能。

目前，CRISPR-Cas9系统已应用于细菌、酵母、斑马鱼、小鼠以及人类细胞基因组修饰等方面。但是，现有的CRISPR-Cas9系统在细胞基因组修饰方面效率较低，不同实验室结果差异较大；另外，细胞阳性克隆筛选常采用共转抗性表达载体或流式细胞筛选或单细胞稀释接种，这些方法具有各自的缺陷，如共转抗性表达载体筛选获得单克隆细胞纯度低、抗性基因的插入导致生物安全性问题，流式细胞筛选后细胞伤害较大，尤其对于原代细胞，单细胞稀释接种流程繁琐、细胞接种密度低导致细胞生长受抑。这些不同不足的存在影响了CRISPR-Cas9系统的广泛、高效应用。

因而，现阶段的CRISPR-Cas9系统仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种切割效率高、安全高效、重复性好、无标记基因修饰细胞的新型CRISPR-Cas9系统。