[发明专利]适于转化细胞的构建体、系统及其应用有效
| 申请号： | 201410017168.3 | 申请日： | 2014-01-14 |
| 公开（公告）号： | CN104774860B | 公开（公告）日： | 2018-07-17 |
| 发明（设计）人： | 李勇;田凯;张欢欢;刘楚新;李飞达;苗泽圃;刘欢;张耕耘 | 申请（专利权）人： | 深圳华大生命科学研究院;深圳华大三生园科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201 | 代理人： | 李志东 |
| 地址： | 518083 广东省深*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 构建体 转化细胞 哺乳动物细胞 筛选标记基因 附着子序列 核酸序列 可操作地 切割效率 应用提供 有效实现 剪切 表达框 共转染 无标记 细胞株 修饰 细胞 基因 应用 安全 | ||
1.一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，包含编码CaS9的核酸序列，所述编码CaS9的核酸序列来源于化脓性链球菌，所述编码Cas9的核酸序列表达Cas9蛋白，所述编码CaS9的核酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，进一步包括第一启动子，所述第一启动子与所述编码CaS9的核酸序列可操作地连接。
3.根据权利要求2所述的一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，所述第一启动子为CMV启动子。
4.一种适于转化细胞的系统，其特征在于，包括：
第一构建体，所述第一构建体为权利要求1～3任一项所述的适于转化细胞的构建体；以及
第二构建体，所述第二构建体为第二适于转化细胞的构建体，
所述第二适于转化细胞的构建体包含：附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框。
5.根据权利要求4所述系统，其特征在于，所述细胞来源于哺乳动物。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述哺乳动物为猪、牛、羊或小鼠。
7.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述附着子序列为编码EBNA1的核酸序列。
8.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述tracrRNA序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述crRNA序列为选自GHR、CRY2、IL2RG、RAG、MSTN和BRCA1基因的至少之一的特异位点序列。
10.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述crRNA序列为选自SEQ ID NO：3-38和SEQ ID NO：46-47所示的核苷酸序列的至少一组。
11.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述第二适于转化细胞的构建体进一步包括第二启动子，所述第二启动子与所述gRNAs表达框可操作地连接。
12.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述第二启动子为适于表达小片段RNA茎环结构的启动子。
13.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述第二启动子为选自U6和H1启动子的至少一种。
14.根据权利要求13所述的系统，其特征在于，所述第二启动子为U6启动子。
15.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述第二适于转化细胞的构建体进一步包括筛选标记基因。
16.根据权利要求15所述的系统，其特征在于，所述筛选标记基因为药物抗性基因。
17.根据权利要求16所述的系统，其特征在于，所述药物抗性基因为新霉素抗性基因和氨苄青霉素的至少一种。
18.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述第二适于转化细胞的构建体进一步包括MCS序列。
19.根据权利要求18所述的系统，其特征在于，所述MCS序列由SEQ ID NO：44-45所示的核苷酸序列退火形成。
20.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述第二适于转化细胞的构建体进一步包括复制起点。
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