[发明专利]新的胚胎干细胞培养体系及胚胎干细胞建系方法

说明书

本发明涉及生物技术领域、具体涉及新的胚胎干细胞培养体系以及采用本发明所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法。本发明所述培养体系包括：DMEMF12、N‑2supplement、B‑27supplement、β‑巯基乙醇、谷氨酰胺、胰岛素、牛血清白蛋白、双抗(青霉素+链霉素)、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子(LIF)、Knockout Serum Replacement(KoSR)、P53inhibitor、Y‑27632、P38MAPK inhibitor和Forskolin。本发明新型的培养体系及其方法既能保证得到稳定的胚胎干细胞系，又能够显著性提高胚胎干细胞的建系效率，同时还能维持胚胎干细胞的多能性，使其始终处于优良的生长状态，从而更好地推动胚胎干细胞在转基因和疾病模型领域的广泛应用。

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及新的用于胚胎干细胞的新的培养体系以及采用所述培养体系提高胚胎干细胞建系效率的方法。

背景技术

1981年，英国科学家马丁·埃文斯首次建立了小鼠胚胎干细胞系，开启了胚胎干细胞领域的研究工作(Evans and Kaufman，1981)。此后，Nicholas M.Gough等发现一种被称之为白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factors，LIF)的化合物，它能够维持小鼠胚胎干细胞保持未分化状态，使得小鼠ESCs能够在体外长期稳定地传代培养(Williams eta1.，1988)。随着研究的愈发深入，科学家们对小鼠ESCs的多能性调控机制的研究也越来越透彻(Niwa et al.，2009)，这样也推进了小鼠培养体系的跟进和发展。从最初的胎牛血清培养基，到Invitrogen公司推出KoSR替代胎牛血清，再到应用最为广泛的“代胎体系”，培养基的发展实现了从有血清到无血清、从成分不明确到确定化学成分的过程；而且通过培养基的不断更新和发展，具有不同遗传背景的小鼠品系，如C57BL／6、DBA2、CBA、NOD等，均在体外成功地得到了ESC细胞系，这对于疾病模型的建立、转基因及胚学研究都具有重要意义。

然而，具有不同遗传背景的小鼠胚胎体外建立ESCs细胞系的能力是不一样的(Hanna et al.，2009)。远交封闭群来源的ESCs体外建系能力是最容易的，如129Sv、CD-1等，利用传统的胎牛血清培养体系，就可以高效率建立ESCs细胞系，但是近交品系来源的小鼠ESCs在此培养条件下建系则十分困难，如C57BL／6、NOD等，其建系效率几乎为零。随着KoSR血清替代品的出现，近交系小鼠ESCs的建系效率得到了极大的提高，但是其不同细胞系的生长状态差异较大，不是特别稳定。

Evans，M.J等人(′Establishment in culture of pluripotential cellsfrommouse embryos′，Nature(1981)292(5819)：154-6；Williams，R.L.等人(′Myeloidleukaemia inhibitoryfactor maintains the developmental potential of embryonicstem cells′，Nature(1988)336(6200)：684-7)公开了“FBS(15％)的培养体系，但是该体系只限于特殊背景(如封闭群品系小鼠)的胚胎干细胞建系，而对于其他背景(如近交系小鼠)的胚胎干细胞建系则无法实现，且在“FBS(15％)”体系内，胚胎干细胞的生长状态一般，克隆集落相对较小。