[发明专利]新的胚胎干细胞培养体系及胚胎干细胞建系方法

权利要求书

1.一种胚胎干细胞培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：DMEMF12、N-2Supplement、B-27 Supplement、β-巯基乙醇、谷氨酰胺、胰岛素、牛血清白蛋白、青霉素+链霉素的双抗、Pd0325901、Chir99021、白血病抑制因子、Knockout Serum Replacement、P53inhibitor、Y-27632、P38 MAPK inhibitor和Forskolin；其中，所述培养体系以总溶液为计算基础，其中DMEMF12为90％～97％；N-2 Supplement为1:50～1:200；B-27 Supplement为1:25～1:100；β-巯基乙醇为0.05～0.2mM；谷氨酰胺为1mM～5mM；胰岛素为10μg/mL～50μg/mL；牛血清白蛋白为0.001％～0.005％；青霉素+链霉素的双抗为1：50～1：100；Pd0325901为0.8μM～2μM；Chir99021为3μM～10μM；白血病抑制因子为1000U/mL～10000U/mL；Knockout Serum Replacement为3％～10％；P53 inhibitor为2μM～50μM；Y-27632为5μM～10μM；P38 MAPK inhibitor为5μM～20μM；和Forskolin为10μM～20μM。

2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系为：DMEMF12为92％～96％；N-2 Supplement为1：80～1：120；B-27Supplement为1：25～1：75；β-巯基乙醇为0.07mM～0.15mM；谷氨酰胺为2mM～4mM；胰岛素为10μg/mL-30μg/mL；牛血清白蛋白为0.002％～0.004％；青霉素+链霉素的双抗为1：70～1：100；Pd0325901为0.8μM～1.5μM；Chir99021为3μM～6μM；白血病抑制因子为1000U/mL～6000U/mL；Knockout SerumReplacement为3％～8％；P53 inhibitor为2μM～10μM；Y-27632为5μM～8μM；P38 MAPKinhibitor为5μM-8μM；和Forskolin为10μM～15μM。

3.根据权利要求2所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系为：

4.一种用于小鼠、大鼠或兔子胚胎干细胞系的建系方法，其特征在于，所述方法包括：

1)取囊胚，接种在铺有饲养层的孔板内，放置在37℃、5％CO₂的培养箱内，用权利要求1-3任一所述的培养体系进行孵育培养；

2)培养至囊胚贴壁后形成生长晕，用口吸管调取生长晕，放置在事先37℃预热的0.25％胰酶滴中，37℃消化；然后用口吸管将生长晕吸出，并直接吹入到含有权利要求1-3任一所述培养体系的新孔内并吹散生长晕，放置于37℃、5％CO₂的培养箱内继续培养，记为P1代；

3)培养至克隆集落长大后，弃上清液，用0.25％的胰酶消化整个孔；然后用含10％的血清的培养液终止胰酶消化，并反复吹吸；之后将细胞和液体统一转移到离心管内，离心；

4)离心完毕后，弃上清，用培养液重悬沉淀，并按照合适的比例将细胞接种在新的培养皿内，记为P2代；

5)重复3)和4)步骤，直至形成稳定的胚胎干细胞系。