[发明专利]一种两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种实现微生物种群鉴定的方法，具体涉及一种两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法及其应用。

背景技术

微生物的鉴定在疾病预防和治疗方面有广泛的应用。快速、准确地检测微生物在疾病传染和抗菌治疗中有重要的作用，尤其是少量致病微生物的检测。例如，近年来肺结核疾病治疗中抗药株给治疗带来很大的困难，需要对菌株进行有效的鉴定，以便采取个体化用药的针对性治疗。常用的手段是将微生物系统分类发育标记分子（phylogenetic markers）可变区进行PCR扩增分析。目前，基于系统分类发育标记分子的微生物鉴定方法普遍用于微生物的分离和鉴定。这些系统分类发育标记分子有16s rRNA、18s rRNA、rnpB、ropB、gyrB基因等。这些系统分类发育标记分子普遍存在于微生物中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它们适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。基于PCR扩增系统分类发育标记分子序列来鉴定微生物种群的方法主要有Sanger测序，焦磷酸测序，Real-TimePCR、PCR-DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）、PCR-RFLP（restriction fragment length polymorphism）等。其中，最准确的方法为Sanger测序、焦磷酸测序，即是将PCR产物的序列的碱基信息完全测定，然后与菌株的特征序列的碱基信息进行比对来确定，这些将特征序列的碱基信息完全确认的测序方法被认为是金标准。然而，Sanger测序受特定设备的限制，需要到指定的场所进行测定，使得时间上受限。相对而言，焦磷酸测序需要的仪器价格便宜，简易的焦测序仪甚至可以方便携带于现场进行分析。传统的焦磷酸测序方法通过每次加入一种核苷酸进行实时合成测序。每次测序反应都能得到碱基的具体信息。通过测序得到系统分类发育标记分子的序列，然后与数据库中的菌株序列比对，鉴定具体的菌株。但是，对于传统的焦测序平台用于这些特定PCR产物的序列分析而言，在DNA模板量少，以及老旧的传统焦测序仪器上，要准确获取长度约为50bp的序列信息不仅费时，而且往往很难。所以，需要提出一种有效分离和鉴定微量微生物种群的方法。

本实验室提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法（ZL201210128597.9），该方法通过同时加入未标记的两种dNPTs实时测序，得到一组编码。该方法中两核苷酸测序方式可以有三种方式：AG/CT，AC/GT，AT/CG。采用该方法对PCR产物进行测序，要么将PCR产物分为两份，要么对PCR产物焦测序之后再进行变性。前者，对PCR产物样本的需求量大，不利于微量模板的检测和鉴定。后者，产物变性会相应的增加测序步骤和测序时间，降低测序效率。但是，通过两核苷酸同时加入到测序反应中，相同模板浓度的情况下，测序得到的峰谱信号比传统焦测序的峰谱信号强，即峰高更高。这一特点有利于检测微量样本。另外，通过两核苷酸同时加入到测序反应中，模板所需的测序反应次数会相应的减少，且不同模板在不同的测序方式下得到的峰谱信息不同，以及每次反应得到的峰谱信号强度也不同。所以，可以通过比较模板测序反应次数以及每次反应得到的峰谱信号强度来鉴定微生物。所以，我们提出一种基于两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物的方法。

本发明的目的是提供一种微量微生物鉴定的方法。通过两核苷酸同时加入到测序反应中，得到一系列峰谱信息图。在峰谱图中，不同模板所需的测序反应次数不同，且在不同的测序方式下得到的测序反应峰谱信号强度不同。通过这一原理可实现微生物菌群的鉴定。该方法能有效提高微生物鉴定的灵敏度、缩短操作时间、为微生物的分离和鉴定提供一种可靠的选择。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种两核苷酸实时合成测序图谱实现微生物种群鉴定的方法。本发明为微生物种群的分类和鉴定提供了一种可行的检测方法，有助于简化微生物种群的鉴定。