[发明专利]基于前导肽置换突变的谷氨酰胺转胺酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及谷氨酰胺转胺酶的改造，特别是一种对前导肽进行置换突变的比酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，属于酶工程领域。 

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。 

链霉菌TGase是以无活性的酶原(pro-TGase)进行合成和分泌，其N端前导肽(pro-peptide)被胞外活化蛋白酶切割后，才会使TGase表现出催化活性。前导肽位于TGase活性裂缝上方，形成一个L状结构，由N端α-螺旋、中间松散的loop和C端小α-螺旋组成。其N端25个氨基酸(9-33)位于成熟酶活性裂缝内，其中Y12和Y16位于催化位点Cys64-Asp255-His274的上方，阻止了底物酰基受体和供体的进入，从而使pro-TGase无催化活性。链霉菌来源TGase前导肽对pro-TGase折叠和分泌具有重要影响。 

为提高谷氨酰胺转胺酶表达量低及酶活低的现状，本研究通过氨基酸缺失对谷氨酰胺转胺酶前导肽进行分子改造，提高谷氨酰胺转胺酶的比酶活。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种基于前导肽置换突变的高比酶活谷氨酰胺转胺酶突变体。 

编码所述谷氨酰胺转胺酶突变体的核苷酸序列为如下（a）或（b）的基因： 

（a）核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的基因； 

（b）核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的基因。 

所述突变是将吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶前导肽C端α-螺旋^37-42(QPGNSL)分别置换成3个丙氨酸或3个甘氨酸。 

本发明要解决的另一个技术问题是提供构建所述谷氨酰胺转胺酶突变体的方法，是通过定点突变技术将吸水链霉菌pro-TGase前导肽C端α-螺旋^37-42中的6个氨基酸(QPGNSL)分别置换成3个丙氨酸或3个甘氨酸。包括以下步骤：以含有编码pro-TGase的基因的质 粒（pBB1-1011）为模板利用定点突变技术，将pro-TGase前导肽C端α-螺旋^37-42中的6个氨基酸(QPGNSL)分别置换成3个丙氨酸(AAA)或3个甘氨酸(GGG)，以获得TG突变体的基因；将TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，测序验证后，转化表达宿主E.coli BL21。 

将前导肽α-螺旋^37-42中的6个氨基酸(QPGNSL)置换成3个丙氨酸所用引物pro-37-42AAA-F：5’-GCCGCCGCCGCGGAATTGCCGCCGAGCGTC-3’和pro-37-42AAA-R：5’-ACCCGCAGTCAGGGCCCTTTTGTTC-3’。 

将前导肽α-螺旋^37-42中的6个氨基酸(QPGNSL)置换成3个甘氨酸所用引物pro-37-42GGG-F:5’-GGCGGCGGCGCGGAATTGCCGCCGAGCGTC-3’和pro-37-42GGG-R：5’-ACCCGCAGTCAGGGCCCTTTTGTTC-3’。 

与Streptomyces hygroscopicus野生酶相比，本发明所提供的S.hygroscopicus TGase突变体pro-37-42AAA和pro-37-42GGG的比酶活分别提高了22.2%和24.8%；K_m值降低，更利于底物与催化活性中心的结合；由于突变酶前导肽C端loop转变成一个螺旋结构，使活化蛋白酶更容易识别切割位点，使得突变酶向成熟酶转化过程明显快于野生酶。 

附图说明

图1SDS-PAGE检测pro-37-42AAA和pro-37-42GGG蛋白分泌；a：发酵上清；b：全细胞；c：纯化TGase；M：蛋白质标准分子量；1：野生酶；2：pro-37-42AAA；3：pro-37-42GGG。