[发明专利]F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍体细胞适应方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍体细胞适应方法。

背景技术

流行性腮腺炎，简称腮腺炎或流腮，是由腮腺炎病毒所致的急性全身性传染病。腮腺炎在世界范围内流行，全年均可发病，以冬春季为主。任何年龄均可发病，以5～15岁患者居多，1岁以下和15岁以上很少发病。感染后一般可获得终身免疫。感染潜伏期14～25日，平均18日。临床特征为腮腺肿痛，可伴发热、头痛等。早期患者及隐性感染者均为传染源。通过空气飞沫或直接接触唾液及唾液污染的食具玩具等传播。MuV是腮腺炎的最常见的病因，可引起脑炎、睾丸炎、卵巢炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、心肌炎、乳腺炎、甲状腺炎等。大多数严重并发症在成人中较多见，青春期后男性患者中25％出现睾丸炎。有1-10％临床腮腺炎患者出现轻型无菌性脑膜炎，腮腺炎脑膜炎可造成永久性后遗症，包括瘫痪、癫瘸、颅神经麻痹、脑积水等。经发现，妊娠早期（3个月内）感染腮腺炎病毒的孕妇有25％会自然流产，其发生率高于风疹病毒感染。

在我国，尽管已在大范围人群内使用了疫苗，但是近年来腮腺炎呈现一种高发的态势，以卫生部公布的全国法定传染病疫情为例，流行性腮腺炎连续几年均高居全国丙类传染病报告数的第二位。国际通用的Jeryl--Lynn株及我国使用的S79株减毒毒种均属于流行于60年代后的A基因型，而当前我国流行的腮腺炎病毒株主要为F基因型。不同基因型之间的中和抗原会有一定差异，可能会导致不完全交叉性保护。我国近10年来腮腺炎减毒活疫苗纳入免疫规划，无偿接种，但腮腺炎的发病率依然维持在较高水平。此外，目前我国常规使用的Jeryl-Lynn株及S79株减毒活疫苗均是以鸡胚细胞为基质进行生产而来的。鸡胚细胞（CEC）作为一种异源性细胞基质，可能带来过敏反应；可能携带传染性禽逆转录病毒；并且每批原代细胞质量不稳定，导致对同一个病毒灵敏度存在差异,影响产品的稳定性等不足。而使用人二倍体细胞进行腮腺炎减毒毒种的制备，不存在致肿瘤的潜在危险性；能够充分鉴定和标准化；可实现细胞种子库系统，有利于质量控制。

因而，通过在人二倍体细胞上对腮腺炎病毒进行适应性培养，从而分离及研究开发我国流行的腮腺炎病毒绝对优势F基因型的代表株，开发我国本土疫苗毒株，对我国腮腺炎的防控具有重要的科学意义和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍体细胞适应方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种F基因型腮腺炎病毒株MHM-19的二倍体细胞适应方法，将人胚肺二倍体细胞MHL-3加入到预温到36-37℃的MEM细胞培养液中，置于36-37℃培养，经2-3天长成单层细胞后接种F基因型腮腺炎病毒MHM-19株悬液，每75cm²培养瓶接种1mL病毒悬液，加入维持液，置于32-34℃培养，培养7-10天后，将细胞冻融三次，将病毒释放到细胞上清液中，制成病毒悬液；按以上方法，将F基因型腮腺炎病毒MHM-19株连续在MHL-3细胞上传代28次，获得在MHL-3细胞上适应性好的F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。其中，所述维持液为含有2%小牛血清的MEM细胞培养液。

优选地，将人胚肺二倍体细胞MHL-3加入到预温到37℃的MEM细胞培养液中，置于37℃培养，经2-3天长成单层细胞后接种F基因型腮腺炎病毒MHM-19株悬液，每75cm²培养瓶接种1mL病毒悬液，加入20mL维持液，置于33℃培养，培养10天后，将细胞冻融三次，将病毒释放到细胞上清液中，制成病毒悬液；按以上方法，将F基因型腮腺炎病毒MHM-19株连续在MHL-3细胞上传代28次，获得在MHL-3细胞上适应性好的F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。

本发明还提供按照上述方法制备的F基因型腮腺炎病毒的二倍体细胞适应株MHM-19。

本发明还提供所述F基因型腮腺炎病毒的二倍体细胞适应株MHM-19在制备腮腺炎疫苗中的应用。

本发明还提供所述F基因型腮腺炎病毒的二倍体细胞适应株MHM-19在制备用于预防腮腺炎的药物中的应用。

本发明中涉及的F基因型腮腺炎病毒MHM-19株的分离方法包括以下步骤：

a使用咽拭子采集腮腺炎急性感染患者口腔颊壁粘膜分泌物，悬于2mL Hanks平衡盐溶液中；

b将分离的咽拭子样品经过0.22μm滤膜过滤除菌，并进行细胞培养物培养增殖，即为F基因型腮腺炎病毒株MHM-19。