[发明专利]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法。

背景技术

在植物病害控防研究中，许多基础问题的研究或重要理论问题的研究均离不开人工接种发病这基本手段。植物病害人工发病可以在活体植株上接种，也可在植物离体器官材料上接种。采用活体植株接种发病的研究结果，虽然更能反映寄主-病菌互作的本貌，但在活体上接种，往往需要较多的时间和空间场地，耗费较多的精力和财力，而且在许多情况下，局部条件控制的难度较大；而采用植物离体器官材料接种发病，往往需要较少的时间和空间需求，简单易行，接种发病的局部条件较容易控制，容易提高试验的规模与效率；许多植物病理学问题，采用离体材料接种发病手段进行研究，也能达到研究目的，或者说，采用在离体材料上接种与在活体植株上接种的研究结果是一致的。因此，在稻瘟病、稻纹枯病、小麦赤霉病、小麦白粉病、大豆锈病、马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、以及瓜类疫病、瓜类霜霉病、多种作物炭疽病等许多重要植物病害研究中，均有采用离体接种方法进行有关研究。

烟草青枯病全球普遍发生，是烟草生产的毁灭性病害，该病害的病原菌（Ralstonia solanacearum）也是当前国际上研究植物病原细菌致病机制的模式系统之一。在烟草青枯病的有关研究中，也有许多采用离体叶接种人工发病的应用案例，但长期以来，烟草青枯病离体叶人工发病，主要采用如下的技术方法。

用注射器将青枯病菌菌液通过细小的针头注入叶片组织内，或者通过无针头方式将菌液压渗入叶片组织内，并以接种点附近组织的色泽变化为主要依据，判别接种发病的结果。虽然该接种方法体系很有效，但也存在一些明显的弊病：1）操作技术难度大，要将细菌液准确地压渗入或者注入到厚度与针头直径几乎等同的较薄的烟草叶片组织内，不但需要训练有素的操作者，操作的效率也较为低下；2）接种结果主要表现为在接种点附近组织的局部坏死，与该病害的系统侵染症状有一定的差距。在高节奏的当代工作中，往往要求应用的技术方法工作起来简易便捷，并能高效率、高通量和高准确性，上述的弊病显然使得当前的烟草离体接种方法难以适应要求。

烟草青枯病的主要症状表现为萎蔫，同时还可以引起输导系统及其附近组织的坏死，叶片的输导组织分布在叶脉上，输导系统及其附近组织的坏死，可导致叶脉外观上呈褐色至黑色的坏死，这种症状特征应在人工接种发病中加以利用，但至今未见有将这种清晰的症状表现，在人工发病实践中的加以应用并建立配套技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，主要内容是将较大的烟草叶片，裁切成保留主叶脉的长片条（简称离体叶脉片），利用一套简单的器具接种烟草青枯病菌，导致离体叶脉片组织坏死而表现出清晰的发病症状，人工发病方法的步骤如下：

1.接种用主要器具准备：接种用的主要器具包括：大方盘、小方盘、玻璃罩、倾斜放置的工作面板；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用。

2.烟苗培育：按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，烟草叶片长度大于20cm即能使用。

3.接种用细菌液的准备：将烟草青枯病菌移植到NA等一般细菌培养基平板上，NA培养基的成分：牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30℃培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水将细菌量调配成10⁸cfu/ml的浓度级别，作为接种用细菌液。

4.离体叶脉片的采集处理：用干净剪刀剪取步骤2烟草植株上的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面，用干净的裁切工具将叶片裁切成保留主叶脉的离体叶脉片备用。

5.在接种器具上放置离体叶脉片：

1）组装接种用主要器具，方法是：取出步骤1备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在工作面板的上下两头，并将工作面板置于小方盘内成稳定的倾斜状态。

2）放置离体叶脉片：取步骤4备好的离体叶脉片，顶端朝上，基端朝下，平行摆放于工作面板上，并挑起橡皮筋将离体叶脉片的两端夹稳。

6.接种病菌：取步骤3准备的细菌液注入步骤5操作完备后的小方盘内，液面浸没离体叶脉片的基端切口。