[发明专利]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法

权利要求书

1.一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，其特征在于，将较大的烟草叶片，裁切成保留主叶脉的长片条，简称离体叶脉片，利用一套简单的器具接种烟草青枯病菌，导致离体叶脉片组织坏死而表现出清晰的发病症状；

方法的步骤如下：

1）接种用主要器具准备：

接种用的器具包括：大方盘、小方盘、玻璃罩、倾斜放置的工作面板；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用；

2）烟苗培育：

按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，烟草叶片长度大于20cm即能使用；

3）接种用细菌液的准备：

将烟草青枯病菌移植到NA一般细菌培养基平板上，NA培养基的成分：牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30℃培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水调配成细菌浓度为2.5×10⁸cfu/ml，作接种用细菌液；

4）离体叶脉片的采集处理：用干净剪刀，剪取步骤2）烟草植株上的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面，用干净的裁切工具将叶片裁切成保留主叶脉的离体叶脉片备用；

5）在接种器具上放置离体叶脉片：

①组装接种用主要器具，方法是：取出步骤1）备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在工作面板的上下两头，并将工作面板置于小方盘内成稳定的倾斜状态；

②放置离体叶脉片：取步骤4）备好的离体叶脉片，顶端朝上，基端朝下，平行摆放于工作面板上，并挑起橡皮筋将离体叶脉片的两端夹稳；

6）接种病菌：取步骤3）准备的接种用细菌液注入步骤5）操作完备后的小方盘内，液面浸没离体叶脉片的基端切口；

7）接种后处置：步骤6）操作完备后，取玻璃罩将小方盘以及盘内的工作面板和离体叶脉片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入薄层清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在28～30℃。

接种结果导致离体叶脉片出现非常清晰的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，接种后2天开始表现症状，5～7天后整个叶脉片全部坏死。