[发明专利]一种灵芝子实体HPLC指纹图谱的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种灵芝子实体HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，属于药用菌分析技术领域。

背景技术

灵芝Ganoderma lucidum（Curtis：Fr.）P.Karst.，属于担子菌门Basidiomycota，灵芝科Ganodermataceae，灵芝属Ganoderma P. Karst.。自古便被列为名贵药材，于2000年正式收载入《中国药典》，来源于多孔菌科真菌赤芝【Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）】或紫芝（G.sinense Zhao,Xu et Zhang）的干燥子实体。灵芝含有多种化学成分，其中三萜酸类化合物为主要有效成分之一，且具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、保肝、解毒、抗衰老等作用。近期研究表明，灵芝酸A、F、H具有阻止乳癌生长的作用和作为治疗癌症辅助剂的作用，赤芝酸可以通过线粒体介导的途径诱导人白细胞凋亡以及阻止癌细胞侵染的作用等。但由于灵芝酸类化合物结构相似，且较难得到足量对照品化合物，严重影响了灵芝质量的控制。

中药指纹图谱特指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体特征的图谱或图像。目前指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种或评价中药质量的最有效手段之一。美国食品药品管理局在1996年制定的《FDA关于植物制品的指南》中，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品提供相应的指纹图谱。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。中国国家药品监督管理部门于2000年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准。

经过了数十年的研究，中药指纹图谱使用了包括紫外、红外、气相、高效液相、薄层、核磁共振、扫描电子显微镜、计算机图像分析、电泳技术、同工酶分析法、分析生物学技术、聚类分析技术等许多现代分析测试手段，为中药的物质鉴定和成分分析积累了大量的数据。但从中药全面质量控制的角度看，还远未达到有效地反映和控制中药的整体质量的目的。高效液相色谱（HPLC）指纹图谱在国际上容易获得认可，包括美国、英国、法国、加拿大、德国、日本和印度在内的许多国家更愿意接受HPLC指纹图谱。

由于灵芝结构紧密，并且活性成分往往被包埋于细胞壁或液胞内，细胞壁的阻碍会减慢提取速度，同时也会影响到提取物中有效成分的种类和浓度。这对于采用常规前处理手段建立HPLC指纹图谱，并将其用于灵芝产品质量控制，其方法的准确性受到了严重质疑。因此，本发明采用机械破碎和固定酶处理，以消除细胞壁阻碍，然后超临界CO₂萃取灵芝有效成分，提高了供试液制备效率，并且萃取物的有效成分种类丰富，浓度高，杂质少，使建立的灵芝子实体HPLC指纹图谱信息更全面和精准，对灵芝产品的质量控制提供了高效、稳定的标准方法。

发明内容

本发明的目的是结合酶解处理和超临界CO₂萃取处理灵芝子实体，制备HPLC供试品溶液，然后对该供试品溶液建立HPLC指纹图谱，具体步骤包括： 

（1）供试液的制备方法①酶解处理：取灵芝干品经粉碎，过40~150目筛，加入5~25倍水，浸润30~150min，加入酶制剂（半纤维素酶：纤维素酶：果胶酶，三者质量比例为1~5：1~5：1），用量为灵芝干粉质量的0.5~10%，充分搅拌均匀，于40~60℃保持恒温，pH值2~6条件下酶解2~12h；酶解后，搅拌加热至50~80℃持续30~120min，待冷却后，于-20℃到-60℃, 0.6~1.5MPa条件下真空冷冻浓缩得到酶解后的灵芝干燥物（含水5%以下）。

②超临界CO₂萃取处理：取酶解后灵芝干燥物10~100g，置于超临界CO₂萃取设备，设置温度25~50℃，将95%乙醇泵入管道与CO₂混合，加压至30~50MPa，浸润样品后萃取10~60min，得到灵芝萃取液，经旋转薄膜蒸发仪浓缩至浆液，1~5mL甲醇清洗瓶壁，得到灵芝超临界CO₂萃取浆液。

③过滤处理：取0.25g浆液，甲醇定容至5mL；从中取1mL，0.45um滤膜过滤得到HPLC供试液。