[发明专利]一种灵芝子实体HPLC指纹图谱的建立方法

权利要求书

1.一种灵芝子实体HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于结合酶解处理和超临界CO₂萃取处理制备HPLC供试品溶液，然后对该供试品溶液建立HPLC指纹图谱，具体步骤包括：

（1）供试品溶液的制备：①酶解处理：取灵芝干品经粉碎，过40~150目筛，加入5~25倍水，浸润30~150min，加入酶制剂（半纤维素酶：纤维素酶：果胶酶，三者质量比例为1~5：1：1~5），用量为灵芝干粉质量的0.5~10%，充分搅拌均匀，于40~60℃保持恒温，pH值2~6条件下酶解2~12h；酶解后，搅拌加热至50~80℃持续30~120min，待冷却后，于-20℃到-60℃,0.6~1.5MPa条件下真空冷冻浓缩得到酶解后的灵芝干燥物（含水5%以下）；②超临界CO₂萃取处理：取酶解后灵芝干燥物10~100g，置于超临界CO₂萃取设备，设置温度25~50℃，将95%乙醇泵入管道与CO₂混合，加压至30~50MPa，浸润样品后萃取10~60min，得到灵芝萃取液，经旋转薄膜蒸发仪浓缩至浆液，1~5mL甲醇清洗瓶壁，得到灵芝超临界CO₂萃取浆液；③过滤处理：取0.25g浆液，甲醇定容至5mL；从中取1mL，0.45um滤膜过滤得到HPLC供试液；（2）指纹图谱的制作：HPLC分析条件为色谱柱：ZORBOX SB-C18（4.6×150mm，5um）；流动相：体积分数0.5~1.5%醋酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱程序：0~12min,40%~50%B；12~58min.50%~70%B;58~59min,70%~100%B;59~60min,100%~40%B;柱温：15~35℃；进样量3~15ul；流量：0.6~1.3ml/min；检测波长254nm，参比波长360nm；

（3）标准指纹图谱的确定：按照本发明提供的方法，对11批灵芝药材建立了SFE-HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了15个共有峰；特征峰的保留时间分别为：16.4min、17.1 min、20.2 min、21.1 min、22.9 min、24.3 min、24.7 min、25.6 min、26.8 min、27.5 min、28.1 min、28.9 min、30.3 min、31.1 min、39.1 min，这些共有特征峰构成了灵芝三萜的指纹特征，可作为灵芝子实体三萜的标准指纹图谱。