[发明专利]一种便携快速检测赭曲霉毒素A的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，尤其是涉及一种基于点击化学反应构建的便携快速检测赭曲霉毒素A的方法。

背景技术

赭曲霉毒素A是最普遍的食物污染毒素之一，主要是由一些曲霉菌属和青霉菌属真菌产生，而这些真菌易在谷类作物、水果、啤酒和白酒中生长繁殖。在动物体内，赭曲霉毒素A易于被肠道吸收，容易引起肾脏和肝脏的强毒性，而且还具有致癌、致畸、抑制免疫力等作用。国际癌症研究机构已经将赭曲霉毒素A列为一种潜在的人类致癌物。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(FAO/WHO JECFA)指出食物间接传递给人类的赭曲霉毒素A中，50%是来自于谷类物质。因此很多国家制定了赭曲霉毒素A在谷类物质中的最高限量标准，例如在未加工的谷物中，不能超过5.0 μg/kg，在加工过的谷类物质中，不得超过3.0 μg/kg。随之也涌现出了许多方法对赭曲霉毒素A进行检测，如可被接受的液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术、薄层色谱法，但这些方法所需仪器昂贵，耗时，而且需要专门的培训人员进行操作，检测成本高，因此在一定程度上阻碍了它们的应用。目前一些高灵敏的免疫检测技术也相继报道，如酶联免疫检测法、电化学免疫传感器、荧光免疫检测技术等，然而这些方法都需要依赖于抗体、半抗原以及免疫抗原的制备，该制备过程不但复杂、耗时，而且也需要借助于大型仪器进行检测，不便携带。因此一些灵敏度高、操作简单和成本低的方法需要被开发，例如采用适配体DNA结合技术来降低操作的复杂性。

点击化学是美国化学家Sharpless首先提出的一种合成概念。它主要是基于小分子单元依赖自身的性质快速生成新物质而建立的一类反应。其中Cu(I)催化叠氮与端炔基团的环加成反应是点击化学反应中研究最为广泛，也最为成熟的反应类型之一。该类反应速度快、立体选择性好、产率高、副产物少、对环境污染小，并且原料易得，所需要的反应条件简单、温和，而且氧气和水溶剂所带来的影响较小。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种制备简单、成本低、便于携带、适合现场检测的便携快速检测赭曲霉毒素A的方法。该方法有机地将点击化学快速反应的优势与适配体的高特异性特点结合起来，采用简单便携的血糖仪进行数据采集，大大降低了操作的复杂性和检测成本，提高了灵敏度和选择性。

本发明的目的是这样实现的：

一种便携快速检测赭曲霉毒素A的方法，特征是：具体步骤如下：

1．按照参考文献（Xiang, Y.; Lu, Y.; Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets, Nature Chemistry, 2011, 3, 697-703.），采用巯基-端炔修饰DNA、磺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯钠盐、蔗糖转化酶和三-(2-甲酰乙基)膦制备蔗糖转化酶-端炔修饰DNA；

2．将5.0 μL 0.05 μM的生物素-叠氮修饰DNA、10 μL 链霉素修饰的磁珠一起加入至25 μL PBS缓冲溶液（由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配制的磷酸盐缓冲溶液）中，PBS缓冲溶液的浓度为0.01 M，pH为7.3，在室温下震荡30分钟，促使生物素-叠氮修饰DNA结合在磁珠表面；

3．在步骤2反应结束后的PBS缓冲溶液中加入5.0 μL NaCl和不同浓度的赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素A的浓度范围为0.2 ng/mL～50 ng/mL，在室温下震荡15分钟；反应结束后，采用磁铁进行第一次分离，弃去第一次上层清液，得到下层磁珠，并用PBS缓冲溶液清洗磁珠两次，清洗结束后在磁珠中加入50 μL PBS缓冲溶液混匀，得到含有结合在磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液；

4．取20 μL步骤3中反应所得的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μL步骤1中所得的蔗糖转化酶-端炔修饰DNA溶液、5.0 μL 0.1 mM CuSO₄溶液、5.0 μL 1.0 mM抗坏血酸溶液，在室温下培育10分钟，让抗坏血酸还原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖转化酶-端炔修饰DNA与磁珠表面的叠氮修饰DNA-赭曲霉毒素A发生点击化学反应，得到蔗糖转化酶修饰磁珠溶液；