[发明专利]一种汞离子的超灵敏检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种核酸外切酶III介导的信号放大用于痕量汞离子的快速检测方法。

背景技术

汞离子(Hg²⁺)是一种普遍存在的重金属污染源，对人体危害严重，是环境监测的重要指标。汞离子接触可不同程度地对健康造成一系列有害影响，包括肾脏衰竭、大脑受损、神经系统以及免疫系统损伤。美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量不得超过10nM。目前，汞离子的常规检测方法主要有原子吸收法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法等。但是这些方法操作繁琐，需要麻烦的前处理、专门的分析技术人员以及昂贵的仪器，不利于现场快速分析检测。近年来，利用汞离子能与DNA中的胸腺嘧啶(thymine，T)特异性地结合，形成T-Hg²⁺-T复合物，设计了一系列传感器用于汞离子的检测(Ono，A and Togashi，H.Angew.Chem.Int.Ed.，2004，43，4300-4302)。但是潜在的缺点是检测灵敏度低，难以满足环境样品检测的需要，因此需要通过信号放大来提高检测灵敏度。

核酸外切酶III(exonuclease III，Exo III)能从双链DNA中的3′末端开始逐步切去单核苷酸。该酶的最适底物是双链DNA中的平齐末端或3′凹馅末端DNA，对单链DNA没有活性，也不能切割双链DNA中的3′突出末端(Zuo，X.；Xia，F.；Xiao，Y and Plaxco，K.W.J.Am.Chem.Soc.，2010，132，1816-1818)。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于将基于核酸外切酶III介导的信号放大技术与试纸条检测技术相结合，构建一种痕量汞离子的快速检测方法。该方法具有很高的灵敏度和特异性，操作简单，检测迅速，检测过程无需使用任何仪器。

本发明所采取的技术方案是：

一种汞离子的超灵敏检测方法，包括如下步骤

(1)构建茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；

(2)构建辅助DNA：所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg²⁺-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，并形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA；

(3)将待检样品与茎环结构DNA、辅助DNA混合后，静置反应；

(4)往步骤(3)的反应液中加入核酸外切酶III，在有汞离子存在的情况下，茎环结构DNA和辅助DNA通过T-Hg²⁺-T复合物互补，形成含有3’平末端的部分互补双链DNA，核酸外切酶III能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA，所述单链DNA含有茎环结构DNA的环状区和5’端茎状区；

(5)通过检测步骤(4)释放出的单链DNA来判断待检样品中是否含有汞离子。

在汞离子存在的情况下，辅助DNA的5’段与茎环结构DNA的3’端的突出部分及部分茎状区互补，且辅助DNA的3’末端有至少4个碱基不能与茎环结构DNA互补形成平末端。

作为优选的，所述茎环结构DNA中，环状区部分的碱基数为9～12，茎状区部分的碱基数为18～21个，茎状区的碱基数比环状区的碱基数多。

作为优选的，所述茎环结构DNA的突出部分以及辅助DNA的5’端均含有1～5个T碱基。

步骤(5)可采用电化学法、荧光法、比色法、电化学发光法或试纸条法检测释放出的单链DNA。

作为优选的，步骤(5)采用试纸条法检测释放出的单链DNA，所用试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；

所述金标垫上喷射有金标DNA探针1，所述金标DNA探针1与茎环结构DNA的环状区互补；

所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补；

所述质检区上固定有DNA探针3，所述DNA探针3与DNA探针1互补。

一种汞离子的超灵敏检测试剂盒，其包括：

(1)茎环结构DNA：所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；