[发明专利]一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的突变体酶及其应用

说明书

技术领域

本发明公开一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的突变体酶，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（DPE酶）属于D-塔格糖 3-差向异构酶（简称DTE）家族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。DPE酶可分别催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。

随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要经济价值和实际意义的当务之急。D-阿洛酮糖是一种稀有糖，具有多种营养和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低热量的甜味剂。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品，允许用于食品和膳食补充剂中。另外D-阿洛酮糖具有保护胰腺β-胰岛细胞，减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。

虽然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但其在自然界中含量极少且极难获得。生物法制备D-阿洛酮糖是近年来的一个研究热点。良好的生物催化剂的开发对工业应用至关重要。耐热酶具有多种优点，如转化率高，反应速度快，污染少，底物粘度低等。因此，开发具有良好热稳定性的DPE酶对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。

由于来源于野生菌株未经改造的DPE酶在热稳定性等方面存在一定的局限性，限制了其应用范围。本实验室开发的梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶可以有效促进D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化（Min Jia, et al. 2013, Applied Microbiology and Biotechnology, DOI 10.1007/s00253-013-4924-8）。但为获得更适合的生物催化剂，通过定点突变的方法，对DPE酶进行分子改造，进一步提高其热稳定性，以期得到酶学性质更适合工业应用的DPE酶。

发明内容

本发明提供一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的突变体酶及其应用，对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。

本发明的技术方案：一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶DPE的突变体酶G109P，将来源于梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶，进行突变所得的单突变体酶；将原来DPE酶基因中第109位的甘氨酸Gly替换为脯氨酸Pro，命名为G109P。

与野生型酶DPE相比，所述DPE的突变体酶G109P的热稳定性获得提高，以在55℃下的半衰期t₅₀来表示热稳定性，DPE的突变体酶G109P的半衰期为91.5min，是野生型酶DPE的2.13倍。

一种重组表达质粒，其中含有权利要求1所述DPE的突变体酶G109P基因。

一种表达宿主，其被含有DPE的突变体酶G109P基因的重组表达质粒转化。

所述DPE的突变体酶G109P的应用，在化学、食品和制药领域中的应用。

所述梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）ATCC BAA-613的DPE酶基因在GenBank的编号为CLOBOL_00069，基因全长876个核苷酸（见序列表中 SEQ ID No：1），编码291个氨基酸（见序列表中 SEQ ID No：2）。

所述DPE的突变体酶是将其109位氨基酸甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro，命名为G109P（见序列表中 SEQ ID No：4）。G109P的核苷酸序列见（SEQ ID No：3）。

本发明还提供DPE酶的突变体酶G109P的制备方法，其具体步骤为：

1）在梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶模拟结构的基础上确定突变位点；

2）设计定点突变的突变引物，以携带DPE酶基因的载体为模板进行定点突变构建突变质粒pet22b(+)-G109P；

3）将突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；

4）离心菌体，重悬后超声破碎，Ni²⁺柱纯化得到突变体G109P。