[发明专利]鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化。

背景技术

鼠表皮生长因子(Mouse Epidermal Growth Factor，简称mEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽，分子量为6054道尔顿。鼠表皮生长因子能与特异的跨膜受体结合，引起细胞内一系列生化变化，使静止的细胞进入分裂周期，促进细胞增殖，经过一段时间后达到生命平衡，细胞不再无限增殖。因此，鼠表皮生长因子是一种强有力的细胞分裂促进剂，微量的外源鼠表皮生长因子即能够刺激细胞增殖，从而加快受损皮肤和内上皮的再生修复，减少皮肤的畸形。所以，鼠表皮生长因子对烧伤创伤救治、角膜或皮肤移植、外伤性溃疡、胃肠道溃疡和应激性胃粘膜损伤的治疗均起到重要作用。

小鼠的颌下腺是EGF的主要合成部位，EGF合成后，释放到唾液、十二指肠、乳汁、尿液和血液等体液中。但其含量极低，采用冻干小鼠颌下腺的方法分离纯化得到的纯品蛋白量比较少，生物活性低，往往达不到大量制备供研究和临床使用的标准。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是为了解决重组鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中分泌表达的问题，提供一种高效、稳定的表达mEGF工程菌的构建和筛选，以及分离纯化目的蛋白mEGF的方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化，包括以下步骤：（1）构建重组质粒pBSAZ 2.1；（2）电转化表达pBSAZ 2.1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母；（3）阳性重组菌株的筛选；（4）诱导重组菌表达鼠表皮生长因子；（5）鼠表皮生长因子的纯化。

本发明的鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化所述步骤（1）依次包括以下步骤：（a）PCR扩增mEGF-TEV-malE-HIS6基因；（b）将步骤（a）获得的mEGF-TEV-malE-HIS6基因片段和经同样限制性内切酶酶切的质粒pPIC 9k过夜连接处理，将连接产物纯化，转化大肠杆菌JM109感受态中，经过卡纳霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切鉴定，得到重组质粒pBSAZ 2.1进一步地，。

本发明的鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化中所述步骤（2）依次包括以下步骤：（a）、重组质粒pBSAZ 2.1的线性化；b、感受态细胞的制备；c、电转化巴斯德毕赤酵母。

本发明的鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达方法和纯化中所述步骤（3）依次包括如下步骤：（a）利用巴斯德毕赤酵母GS115组氨酸营养缺陷型筛选整合重组菌；（b）G418抗性筛选高拷贝菌株。

本发明采用基因工程的方法，将mEGF基因连接至表达载体上，在巴斯德酵母细胞中完成分泌表达，从而构建出含mEGF目的基因的基因工程菌。巴斯德酵母表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的生物蛋白质分子。胞外分泌型表达是目前最先进的且适于工业化的表达方式，细胞外表达可以避免蛋白在保内聚集形成包涵体，使目的蛋白的下游纯化更加简单，利于大规模处理。

附图说明

图1为重组质粒pBSAZ 2.1构建示意图

图2为 pBSAZ 2.1经Bgl П酶切后琼脂糖凝胶电泳图；

图3 纯化后mEGF蛋白SDS-PAGE电泳图。

具体实施例

实施例1：重组质粒pBSAZ 2.1的构建

一）试验材料

(1) 质粒和菌株

质粒pPIC 9k、pMAL-p5X和大肠杆菌JM109购自Takara生物科技有限公司。

(2) 试剂

限制性内切酶EcoR I和Not I，卡纳青霉素和卡那霉素购自NEB公司。

基因片段mEGF和引物由华大基因合成。

m-F：CGGAATTCAATAGTTATCCAGGAT

m-R:TAATGCTCCTGCTGCGAACTCCTCTAGTAACTGGAAATATAGGTTCTC

M-F：GAGAACCTATATTTCCAGTTACTAGAGGAGTTCGCAGCAGGAGCATTAAAAATAAAAACAGGT

M-R：