[发明专利]利用酪氨酸酶制备的儿茶酚型结构物质、其制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用具有广的基质特异性的酪氨酸酶(tyrosianse)以高的生产率和 收率筛选性地从多种单酚型结构物质(monophenoliccompounds)仅生成儿茶酚型 结构物质的方法。由此，本发明可实现利用酶反应的功能性儿茶酚型结构物质的 批量生产，且可适用于原料化及医疗用产品生产。

背景技术

据报告，很多儿茶酚型结构物质(catecholderivatives)在抗氧化、抗癌、抗炎 症或抗病毒等效果中呈现好的生理活性，与单酚型结构物质(monophenolic compounds)相比，其效果更高。尤其，儿茶酚型结构物质作为酪氨酸酶(tyrosinase) 的抑制剂利用，并具有减少基于酪氨酸酶的黑色素(melanin)的生产的效果。并且， 众所周知，在大豆甙元(daidzein，来源于大豆的异黄酮)中，特异性地实现邻羟基 化(ortho-hydroxylation)的3’-邻羟基大豆甙元(3’-ODI，3’-orthohydorxydaidzein)的 一部分存在于熟成的大酱中，预防由紫外线引起的皮肤癌，并抑制与癌转移相关 的活性(JBC，2010，vol.285，pp.21458；JBC，2011，vol.286，pp.14246)。作为 来源于芹菜素(apigenin)的儿茶酚型物质，羟基化的木犀草素(luteolin)在抗氧化性 好的洋蓟(arichoke)中可提取极少量，据最新报告，可在乳腺癌治疗中使用(Food Chemistry，2013，"Luteolinsensitisesdrug-resistanthumanbreastcancercellsto tamoxifenviatheinhibitionofcyclinE2expression")。除此之外，众所周知，橄榄 油中的羟基酪醇(hydroxytyrosol)、葡萄酒中的白皮杉醇(piceatannol)等的儿茶酚型 物质还用作强力的抗氧化剂。高分子物质上的儿茶酚型结构物质可摹仿贻贝蛋白 质的功能，其应用领域从医疗物质至表面改性纳米工程正广泛地进行研究(Annu RevMaterRes.2011141：99-132Biofouling2012，28：8，865-877)。

在利用以往的生物催化剂来生产儿茶酚型结构物质的情况下，利用包括P450 酶在内的多种单加氧酶(mono-oxigenase)。但是，在大部分的单加氧酶的情况下， 需要辅酶，并需要用于电子传递的双还原酶(reductase)。这会影响基质的生物转 化反应速度，并由低的收率和生产率引起。相反，酪氨酸酶的单酚结构物质氧化 反应相对快(作为参考，来源于蘑菇类的酪氨酸酶的kcat/Km值为大致 1000mM^-1s-¹)，不伴随用于辅酶的电子传递反应的双酶。

但是，酪氨酸酶的问题如下：使单酚型结构物质羟基化，来在生产儿茶酚型 结构物质的第一次羟基化反应(monophenolaseactivity)之后，在单酚型结构物质中 生物转化的儿茶酚型结构物质借助酪氨酸酶的第二次氧化反应(dipehnolase activity)生物转化为醌型物质(quinoniccompounds)。通常，醌型物质形成自由基 (radical)来快速形成黑色素(melanin)，生成的黑色素以稳定的结构体具有阻隔紫外 线区域的光的功能。

酪氨酸酶由活性部位周边6个组氨酸(Histidine)固定两个铜离子，上述两个 铜离子之间的距离在包括铜的儿茶酚氧化酶(catecholoxidase)和其他酪氨酸酶组 中规定地保持。根据氧的存在与否，并根据在两个铜之间结合的氧原子的数量， 酪氨酸酶区分为三种形态，即，脱氧形态(脱氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))、氧 形态(氧-酪氨酸酶(oxy-tyrosinase))及甲硫氨酸形态(甲硫氨酸-酪氨酸酶 (met-tyrosinase))。

脱氧形态(脱氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))为两个铜离子之间不包含氧的形 态，若不供给氧，则成为无法进行羟基化及氧化反应的非活性体。

若在空气中，氧在溶剂中解离或供给过氧化氢，则在脱氧形态的两个铜离子 之间固定一个氧(O₂)分子，并将这种形态称为氧形态(氧-酪氨酸酶 (oxy-tyrosinase))。在这种氧形态中，若单酚的氧原子与一个铜离子相结合，则开 始酪氨酸酶的第一次羟基化反应。