[发明专利]用于透化固定的血细胞的组合物及其用途

说明书

本发明涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物、所述组合物的用途，和一种处理生物样品的方法，所述方法包含固定所述样品以及随后使所述生物样品与所述细胞处理组合物接触。本发明进一步涉及一种包含所述细胞处理组合物的试剂盒。

对相关申请的交叉引用

本申请作为PCT国际专利申请于2013年12月23日提交申请，并主张2012年12月28日申请的61/747,044号美国专利申请为优先权，此处通过引用方式包含其全部公开内容。

技术领域

本发明涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物、所述细胞处理组合物的用途以及一种用于处理生物样品的方法，所述生物样品包含用于后续细胞内和/或细胞外表位如磷酸表位分析的固定的白细胞。本发明进一步涉及一种含有所述细胞处理组合物的试剂盒。

背景技术

细胞(例如，血细胞)分析领域的最近的发展，已经能够提供有价值的工具用于对细胞内和细胞表面的细胞结构进行详细分析。为了检测特定的细胞结构的存在，通常使用多标记的结合剂例如对细胞外和/或细胞内确定的标记物具有特异性的单克隆抗体，对细胞进行染色，以此来区分特定的目标细胞。例如，通常通过使用特异性细胞表面标记物来区分不同亚类的白细胞，然而多种细胞内标记物，例如与细胞质或细胞核相关的结构，对于研究所研究的细胞的功能特性变得更加重要。可以通过合适的设备，优选流式细胞仪，对通过所述特异性结合剂标记的细胞进行分析，所述流式细胞仪能够检测并区分多种标记和其它的细胞特性，如粒度和尺寸。

然而，早期的流式细胞仪的应用主要涉及对细胞表面抗原的检测，其利用各自的抗体是容易实现的，对细胞内靶表位的标记构成了更大的挑战，这是因为为了使细胞膜对各自的结合剂是可渗透的，其需要对细胞进行特殊的预处理，所述结合剂对细胞内目标位置具有特异性。由于必须使细胞膜对于大分子如荧光标记的抗体是充分可渗透的，因此这种透化是关键步骤。同时，不同细胞群的细胞结构需要维持足够的保全，从而保持各自的特征性光散射性能，并且胞质蛋白不流失到细胞外而是保存在自身细胞内。在透化步骤之前或与透化步骤同时通常进行固定步骤以提供这种稳定性。当保全条件变得更严谨，即当使用更强的蛋白变性工序时，这种结构上的保全变得更加困难。

所需要的固定反应经常包含对侵蚀剂(aggressive reagent)，如甲醛的利用，其可以破坏或至少降低通过各自的结合剂区分细胞亚型的表面抗原的可达性(accessibility)。因此，一些早期方法包含利用各自的标记结合剂来标记细胞表面结构的初始步骤。然后，细胞被固定、透化并被对细胞内靶标具有特异性的不同的结合剂处理。接着这些被标记的细胞在，如流式细胞仪中被检测和分类。然而，在目前使用的透化工序中，所需要的成分(甲醛、乙醇和清洁剂(detergent))彼此之间、以及与后续使用的作为结合剂的抗体之间是不兼容的。因此，为了除去干扰试剂的残留物，细胞需要多个清洗步骤。然而，这种处理的严格条件可能较容易地消除一些一些较敏感的细胞表面抗原的抗原反应活性，所述细胞表面抗原经常用于识别各自的靶细胞群，如CD14。

在细胞信号传导的情况中，蛋白质经常要经受可逆的磷酸化。这种动态的磷酸化工序涉及竞争性的磷酸化和去磷酸化反应，在任何一个给定时刻磷酸化水平反映出催化这些反应的蛋白激酶和磷酸酶在此时刻的相对活性。因此，磷酸-表位的分析可以对单个细胞中的信号和代谢过程的调节给出有价值的实时的了解。因此，对于研究和诊断应用来说，对多种信号传导酶如磷酸激酶，例如丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化状态的分析变得越来越重要。例如，对这种磷酸化作用的研究的一个重要应用是对癌症和自身免疫疾病的治疗，其中，特定磷酸-表位的磷酸化或去磷酸化可以指示给患者施用的或体外实验用的磷酸激酶抑制药物的有效性。