[发明专利]多重核酸检测方法

说明书

用于多重连接依赖性探针扩增方法包括(a)提供含有不同靶核酸的样品组织，(b)针对每个靶核酸提供不同的探针组，每个探针组包含具有第一接头序列和第一靶特异性部分的第一基因座特异性探针及具有第二接头序列和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶特异性部分的第二基因座特异性探针，(c)将所述探针组与所述靶序列杂交以形成杂交复合体；(d)连接所述杂交复合体以形成连接的探针，(e)扩增连接的探针以形成扩增子，和(f)通过对每个扩增子进行测序在检测系统中检测扩增子。

背景技术

本文所公开的实施方式涉及核酸，更特别地是涉及靶核酸序列多重检测的方法。

多重连接依赖性探针扩增(MLPA)是允许在单次实验中评估特别是多种靶核酸的拷贝数的多重PCR技术。在MLPA中，所查询的每个靶核酸是通过连接的探针的扩增来检测。连接的探针是通过探针组的杂交和连接产生，所述探针组包含一对设计为沿目标靶核酸序列彼此邻近定位的半探针(half-probe)。只有在半探针与靶核酸杂交时，才发生连接和随后的扩增。

图1示出了典型的MLPA分析的流程图。该分析起始于DNA样品的变性和探针组与它们的靶核酸序列的杂交。在杂交后，连接邻近的半探针，并使得到的连接的探针组经历PCR扩增。然后通过毛细管电泳(CE)分析所扩增的连接的探针组。CE读出结果的峰高度作为基因组靶拷贝数的读出结果。

如图1中所指示的，每个探针组由具有靶特异性序列和通用引物序列的5'和3'半探针组成，允许同时多重PCR扩增所有连接的探针组。另外，半探针中的一个(如图1所示)或两者进一步包括填充序列(stuffer sequence)，其使得更容易区分通过CE进行的扩增探针的检测。使用使得基于核酸长度的CE检测成为可能的这些填充序列对于可在单次运行中查询(query)的靶核酸数量造成限制。目前，该限制是约40个靶核酸。由于与MLPA相关的低成本、高通量潜力和检测小重排的能力，扩增可在单次运行中查询的靶核酸序列的数量是有益的。本公开提供了用于查询数量扩增的这样的方法并也提供相关的优势。

发明内容

根据在本文中说明的实施方式，提供了增加可在多重连接依赖性探针扩增(MLPA)分析中查询的靶核酸数量的方法。

在一些方面，本文所公开的实施方式提供了用于多重连接依赖性探针扩增的方法，其包括(a)提供样品组织以查询多个不同的靶核酸；(b)为所述多个不同靶核酸中的每一个提供多个不同的探针组，其中每个探针组包含：第一基因座(locus)特异性探针，其包含第一接头(adapter)序列和第一靶特异性部分；和第二基因座特异性探针，其包含第二接头序列，和邻近所述第一靶特异性部分的第二靶特异性部分；(c)将所述多个不同探针组与所述多个不同靶序列杂交以形成多个杂交复合体；(d)连接所述多个杂交复合体以形成多个连接的探针；(e)扩增所述多个连接的探针以形成多个扩增子，其中所述扩增步骤使用第一通用引物和第二通用引物进行，所述第一通用引物包含与所述第一接头序列互补的区域，所述第二通用引物包含与所述第二接头序列互补的区域；和(h)通过对所述多个扩增子的每一个进行测序，在检测系统中与长度无关地检测所述多个扩增子。

在其他方面，本文所公开的实施方式提供了方法，其包括提供检测系统，所述检测系统包括配置为在包含多个扩增子的阵列上进行合成测序循环的流体处理系统，所述检测系统被配置为将辐射从源引导至所述阵列并将荧光发射从所述阵列引导至照相机，和包括配置为自动改变所述检测系统以增加引导至所述阵列的所述辐射的暴露水平和在所述增加的暴露下检测从所述阵列到所述照相机的荧光发射的系统控制界面；通过多重连接依赖性探针扩增提供所述多个扩增子；和测定所述多个扩增子的序列。

附图说明

为更好地理解本实施方式，可参考附图。

图1示出了采用毛细管电泳检测系统的多重连接依赖性探针扩增(MLPA)的流程图。

图2示出了根据本文所公开的实施方式的MLPA-合成测序(SBS)的流程图。