[发明专利]纤维二糖水解酶的变体

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月12日提交的美国临时专利申请序列No.61/736,344的优先权权益，并且以引用的方式全文并入本文中。

技术领域

本公开总体上涉及糖苷水解酶变体，特别是纤维二糖水解酶(CBH)的变体。还描述了编码CBH变体的核酸、包含CBH变体的组合物、产生CBH变体的方法以及使用所述变体的方法。

政府权利

本发明是在由美国能源部授予的基金号DE-FC36-08GO18078下、在政府支持下进行的。政府具有本发明的某些权利。

发明背景

纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们能被许多会产生能够将聚合物底物水解成单体糖的胞外酶的微生物(包括细菌、酵母和真菌)降解并且用作能源(Aro等人，2001)。由于对非可再生资源途径的限制，所以纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的(Krishna等人，2001)。通过生物过程对纤维素的有效利用是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya等人，1997)。

纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分成三个主要类型：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡萄糖苷酶([β]-D-葡萄糖苷葡糖水解酶；EC3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，1987；Shulein，1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila，1995)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在是结晶纤维素有效溶解所必需的(Suurnakki等人，2000)。β-葡萄糖苷酶起到从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄糖单位的作用(Freer,1993)。

已知纤维素酶由大量细菌、酵母和真菌产生。某些真菌会产生能够降解结晶形式的纤维素的整个纤维素酶体系，使得纤维素酶容易通过发酵大量产生。由于许多酵母诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)缺少水解纤维素的能力，因此丝状真菌起特殊作用。(参见例如Aro等人，2001；Aubert等人，1988；Wood等人，1988；和Coughlan等人)。

CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可进一步扩展以包括每个分类内的多个组分。例如，已从包括里氏木霉(Trichoderma reesei)的多个真菌来源分离了多种CBH、EG和BG，里氏木霉含有2种CBH的已知基因，即，CBH I和CBH II、至少8种EG的已知基因，即，EG I、EG II、EG III、EGIV、EGV、EGVI、EGVII和EGVIII以及至少5种BG的已知基因，即，BG1、BG2、BG3、BG4和BG5。

为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，需要包含来自CBH、EG和BG每个分类的组分的整个纤维素酶体系，而分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效(Filho等人，1996)。已观察到来自不同分类的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG型纤维素酶和CBH型纤维素酶协同地相互作用以有效地降解纤维素。(参见例如Wood，1985)。

在本领域中已知的是，纤维素酶可用于处理纺织品，用于增强洗涤剂组合物的清洁能力，用作软化剂，用于改善棉织物的触感和外观等(Kumar等人，1997)。

已描述了具有改善的清洁性能(美国专利No.4,435,307；英国申请No.2,095,275和2,094,826)并且用于处理织物以改善纺织品的触感和外观的含有纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利No.5,648,263、5,691,178和5,776,757；英国申请No.1,358,599；静岡県立纺织品工业研究所报告(The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report),第24卷，第54-61页，1986)。

在本领域中进一步已知的是，纤维素酶可用于将纤维素原料转化成乙醇。这一过程具有许多优点，包括否则将丢弃(例如焚烧或土地填埋原料)的大量原料的易于可利用性。已考虑将主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的其他材料，例如木材、草本作物和农业或城市废物用作乙醇产生的原料。