[发明专利]抗-MIF抗体的细胞迁移测定方法

说明书

本发明涉及一种测定方法，其适用于测试抗-MIF抗体的效价。特别地，本发明涉及一种有利的且易于使用的细胞迁移测定方法。

背景技术

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一种细胞因子，最初基于其抑制结核菌素过敏豚鼠(含有巨噬细胞)的腹腔渗出细胞的体外随机迁移能力而被分离(Bloom等，Science 1966年，153，80-2；David等，PNAS 1966年，56，72-7)。今天，MIF作为在具有广谱活性先天性和获得性免疫应答的关键性上游调控子而被众所周知。1989年，人的MIF的cDNA被克隆(Weiser等，PNAS 1989，86，7522-6)，其基因定位于22号染色体。人的MIF基因产物是具有114个氨基酸(N-末端蛋氨酸裂解后)且表观分子量大约为12.5kDa的蛋白质。MIF与任何其他的蛋白质没有显著的序列同源性。该蛋白质结晶为相同亚基的三聚体。每个单体包含两个反向平行的α-螺旋，α-螺旋堆集成四链的β-折叠。所述单体具有另外两个β链，该两β链与相邻亚单位的β-折叠相互作用从而形成单体之间的交界面。三个亚单位排布成一个包含亲溶剂通道的管道，该管道沿分子的三重轴向穿过蛋白质的中心(Sun等，PNAS 1996年，93，5191-5196)。

据报道，低浓度的糖皮质激素可诱导巨噬细胞分泌MIF(Calandra等，Nature 1995年，377，68-71)。然而，MIF也反向调节糖皮质激素的作用并刺激其它细胞因子如肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1β的分泌(Baugh等，危重病急救医学2002，30，S27-35)。MIF还显示出，例如表现为促血管生成、促增殖和抗细胞凋亡的特性，从而促进肿瘤细胞的生长(米切尔，R.A.，细胞信号，2004.16(1)：P.13-19；Lue，H.等，致癌基因2007.26(35)：p.5046-59)。它也与例如淋巴瘤，黑素瘤和结肠癌的生长直接有关(Nishihira等，J干扰素因子细胞因子研究2000，20：751-62)。MIF是许多病理状况的中介体，因而与多种疾病相关，其包括但不限于炎症性肠病(IBD)、风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、血管球性肾炎、IgA肾病、心肌梗死(MI)、败血症和癌症。

多克隆抗体和单克隆抗MIF抗体已被研发，用来抵抗重组的人MIF(清水等，二月快报1996；381，199-202；川口等，Leukoc生化学1986，39，223-232，和Weiser等。细胞免疫学1985，90，167-78)。

已经有人建议抗MIF抗体用于治疗用途。据报道，Calandra等(J.Inflamm.(1995)，47，39-51)使用抗MIF抗体保护动物使其免于来自实验性诱导的革兰氏阴性和革兰氏阳性败血性休克。这表明抗MIF抗体可用作一种治疗手段来调节感染性休克和其它炎性疾病状态中细胞因子的产生。

美国专利6,645,493公开了来源于杂交瘤细胞的单克隆抗MIF抗体，其能够中和MIF的生物学活性。在动物模型中表明这些源于小鼠的抗MIF抗体在内毒素引起的休克的治疗上取得了有益的效果。

美国专利200310235584公开了一种在动物中制备MIF高亲和性抗体的方法，其中MIF基因已经被纯合敲除。

Galat等人描述了糖基化抑制因子(GIF)是一种蛋白质(欧洲生物化学，1994，224，417-21)。MIF和GIF现在被认为是相似的。Watari等(PNAS2000，97，13251-6)描述了与不同的GIF表位结合的多克隆抗体，来识别Ts细胞的经翻译后修饰的GIF的生化性质。同上，Watari等报告了体外GIF呈现出不同构象的同工型。一类异构体产生于单个半胱氨酸残基的化学修饰。该化学修饰导致了GIF蛋白内的构象变化。

需要提供一种可靠且易于使用的测定方法来测试抗-MIF抗体的效价。在诊断和治疗用途上，能够明确给定抗-MIF抗体样本的效价的方法是非常重要的。。如果不能清楚显示出抗-MIF抗体的各自效价，则该方法不能用于任何诊断或治疗。

对于MIF相关药物，尤其是抗-MIF抗体的效价评估的稳定的生物测定方法目前尚未知晓。

虽然在较早的测试中，MIF蛋白表现出趋化因子样作用且这些功能可以被抗-MIF抗体阻断(例如，Bernhagen等，自然医学，2007)，但是迄今为止并没有建立一种基于针对例如单核细胞的自分泌诱导细胞迁移进行抑制合格的稳定的MIF生物测定方法。