[发明专利]从含二硫化物的蛋白质制备缀合物的方法

说明书

背景技术

已将各种各样的化学部分(“有效载荷(payloads)”)共价连接到酶、抗体、以及其它大的多肽或蛋白质中，以形成缀合物(conjugates)。有效载荷可用来定位它们所连接的蛋白质(例如，标签)、修饰蛋白质的物理化学性质或稳定性(例如，聚乙二醇化)、使蛋白质连接到另一分子或蛋白质(用于连接缀合物至另一化合物或另一缀合物的偶联基团)、或修饰有效载荷或蛋白质的功能或活性(例如，疫苗缀合物)。蛋白质也可作为载体来递送所连接的有效载荷至特定组织或细胞类型中，例如在抗体-药物缀合物(ADC)中。可以有用地连接至蛋白质的有效载荷的类别包括可检测部分(标签)、使蛋白质连接到表面或另一化合物的锚定部分(moieties)、与蛋白缀合时引起免疫应答的抗原、与化学互补缀合偶联配偶体很容易反应(因此连接蛋白至另一实体)的偶联基团、以及治疗性部分如细胞毒素和其它生物活性剂。以受控和可重复的方式将这些不同的结构连接在蛋白质上对于缀合物正确地发挥其功能是很关键的。因此，需要有将许多类型的有效载荷连接到许多不同的蛋白质或多肽上的各种方法。

已经开发了用于将有效载荷连接至蛋白质以形成蛋白质缀合物的许多方法。例如，见Sletten,E.M.和Bertozzi,C.R.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,6974–6998；Basle′,E.；Joubert,N.；和Pucheault,M.Chemistry&Biology 2010,17,213-227。在一些蛋白质缀合物中，连接蛋白质和有效载荷的方法可能对缀合物的活性或相关的性质具有检测不到的影响；在其他情况下，蛋白质和有效载荷之间的连接子(linkage)的性质可能显著影响缀合物的活性或性质。有时候，例如控制每蛋白质的有效载荷部分的数目，或控制有效载荷连接的精确位置从而使得它们不会干扰蛋白质功能，是很重要的。例如，ADC需要蛋白质识别并结合到靶细胞的表面结构上以赋予选择性，所以有效载荷的定位一定不能干扰抗体结合其必须识别的表面结构(抗原)。例如，参见Expert Opin.Biol.Ther.2012,12,1191-1206；Toxins 2011,3,848-883；以及Laurent Ducry Drug Delivery in Oncology:From Basic Research to Cancer Therapy,1st Edition.Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA.2012,12,355-374.

大多数用于将有效载荷连接至蛋白质的方法涉及在蛋白质和感兴趣的特定有效载荷之间添加连接化学结构(连接体)。连接体利用每一部分上可利用的官能团，提供了将感兴趣的有效载荷连接到蛋白质的方法。连接体通常使得有效载荷和蛋白质之间的距离能够被调节，并且在释放有效载荷对于实现其目标很重要的情况下，还可以包括能够在体内溶解或降解的可裂解部分，从而从蛋白质释放有效载荷。例如，在ADC中，在其可具有期望效果的位置裂解并释放有效载荷，对于缀合物而言可能是很关键的。由于不同类型的蛋白质-有效载荷缀合物对有效载荷和蛋白质连接的方式存在不同要求，因此对能一贯且有效地将有效载荷连接到蛋白质的新方法存在持续的的需求。

用于形成蛋白质缀合物的最常用的方法依赖于自然存在于许多天然蛋白质中的某些氨基酸的化学反应性：经常使用赖氨酸和半胱氨酸，因为它们提供了将有效载荷连接至蛋白质的反应性位点。赖氨酸具有游离胺基团，其可与连接基团或有效载荷上合适的亲电性官能团反应，且半胱氨酸可以通过其游离巯基反应。然而，依靠这些天然存在的反应性位点可能是复杂的：当所关注的蛋白质上有太多或太少所述特定类型氨基酸时，例如，在蛋白质上得到恰好“载量”的有效载荷变得困难。蛋白表面的高丰度的赖氨酸使得位点和区域选择性缀合变得困难，并导致异质的产物。相反，半胱氨酸是比较罕见的，而且主要以二硫化物连接对存在于蛋白质中。半胱氨酸处的缀合通常需要还原二硫化物，接着与缀合试剂(例如马来酰亚胺)反应，分别标记个体半胱氨酸。因为这消除了二硫键，因此蛋白质结构和稳定性可能会被该方法破坏。