[发明专利]用于产生糖蛋白的组合物和方法

说明书

1.序列表

本申请包括已通过EFS-Web以ASCII形式提交的序列表并将其通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2013年9月24日，名称为381493-735WO(118134)_SL.txt，并且其大小为42,313字节。

2.背景

蛋白质通过糖基化的翻译后修饰导致不同糖形的形成，所述糖形常常具有独特的性质。蛋白质糖基化的差异可对该蛋白质的物理和化学性质(包括该蛋白质对特定靶分子的结合亲和力)具有显著的影响。已知若干种调节蛋白质糖基化的方法。不同的表达系统可产生不同的糖基化模式。此外，蛋白编码序列可被修饰以产生具有升高或降低水平的特定糖形的蛋白质。培养重组细胞系的条件也可影响糖基化模式。

在哺乳动物细胞中重组产生的抗体常常在该抗体的Fc和Fab区上发生糖基化。许多糖基化的抗体包含糖类岩藻糖。岩藻糖在抗体中的存在可影响抗体对细胞上特定蛋白的结合。例如，在抗体的Fc区中包含高水平的岩藻糖的抗体可具有减弱的与淋巴细胞(例如天然杀伤细胞)上的受体的结合。不含岩藻糖的抗体与增强的ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒性)活性相关，尤其是在低剂量抗体的情况下。Shields等人，2002、J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa等人,2003、J.Biol.Chem.278:3466。制备岩藻糖较少的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中的生长。YB2/0细胞表达低水平的FUT8mRNA，所述mRNA编码蛋白质的岩藻糖基化所必需的酶(α1,6-岩藻糖基转移酶)。用于增加ADDC活性的备选方法包括抗体的Fc部分中的突变，特别是增加抗体针对FcγR受体的亲和力的突变。已使用基于细胞的定向细胞毒性测定证实了增加的FcγR结合与突变的Fc之间的相互关系。Shields等人,2001，J.Biol.Chem.276:6591-6604；Presta等人,2002，Biochem Soc.Trans.30:487-490。

培养基或补料培养基中成分的浓度可影响蛋白质的糖基化模式。理想地，可通过控制重组细胞系所生长的条件来增加或减少蛋白质的特定糖形。虽然已有很多研究通过控制培养基的成分来增加蛋白产率，但远少得多的报道涉及通过改良培养重组工程化细胞的细胞培养基来调节蛋白质的糖基化。一个实例公开于美国专利No.5,705,364中，该专利涉及通过将链烷酸添加至培养基来控制由哺乳动物细胞产生的糖蛋白的唾液酸含量的方法。然而，通过改良其中表达重组抗体的培养基来增加抗体的ADCC活性的可能性未得到充分的解决。因此，开发用于培养哺乳动物细胞以表达具有降低的岩藻糖水平和增加的ADCC活性的抗体的细胞培养基会是非常期望的。

3.公开内容概述

本公开内容涉及这样的发现：通过在包含高浓度(例如至少5mM)的甘氨酸的培养基(在下文中被称作“高甘氨酸培养基”)中培养哺乳动物细胞，产生了具有有益性质的糖蛋白(例如抗体)。具体地，在高甘氨酸培养基中培养哺乳动物宿主细胞增加非岩藻糖基化糖形的水平。哺乳动物细胞可被用于产生显示增强的生物活性的抗体，所述增强的生物活性包括增强的抗体依赖性细胞细胞毒性(“ADCC”)活性。

因此，本公开内容总的来说提供用于表达重组蛋白(例如抗体)的方法和组合物，所述重组蛋白相较于在传统培养基中表达的糖蛋白而言具有改良的糖基化模式。所述方法和组合物利用高甘氨酸培养基来在哺乳动物细胞中表达糖蛋白例如抗体，从而有利地导致相较于在传统培养基中产生的糖蛋白而言具有降低的岩藻糖基化水平的糖蛋白。

此外，本公开内容的方法可用于在生产期间调节和控制蛋白质糖基化。在生产期间产品糖基化的改善的控制是期望的，因为这将减小批次报废的风险和改善生产地点之间的技术转移期间和工艺的按比例放大期间的控制。因此，所述方法可用于维持可再现的产品糖基化模式而无需引入工艺变化。

能够经工程化以产生重组糖蛋白的哺乳动物细胞包括NS0细胞、CHO细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞、幼仓鼠肾BHK-21细胞和人胚肾HEK0291细胞。在具体的实施方案中，NS0细胞被重组工程化以产生抗体。