[发明专利]用于生产诱导肝细胞的方法和组合物

说明书

相关申请

本申请要求于2013年3月12日提交的美国临时申请第61/777,973号和2012年9月7日提交的美国临时申请第61/698,359号的权益，其二者均整体地并入本文以作参考。

序列表

本申请含有以ASCII格式经由EFS-Web提交的序列表，其整体地并入本文以作参考。所述ASCII拷贝创建于2013年8月15日，命名为P4968R1-WO_SL.txt，大小为48,692字节。

发明领域

本发明涉及用于通过重编程非肝细胞而产生诱导肝细胞的方法和组合物。

发明背景

Takahashi和Yamanaka于2006年报道了将编码四种蛋白质因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)的基因导入到分化的小鼠成体成纤维细胞中诱导这些细胞成为多能干细胞(诱导多能干细胞)(参见Takahashi和Yamanaka(2006)Cell 126:663-676)。在这篇原始报道之后，还通过用编码类似的人类蛋白质因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的基因转化人类体细胞，或通过用编码人类OCT4和SOX2因子的基因加上编码两个其它人类因子(NANOG和LIN28)的基因转化人类体细胞，在人细胞中诱导多能干细胞(分别参见Takahashi等人,(2007)Cell 131:861-872和Yu等人,(2007)Science 318:1917-1920；参见Huangfu等人,(2008)Nature Biotechnology 26:1269-1275)。报道的这些方法使用反转录病毒或慢病毒使得编码重编程因子的基因整合到转化的细胞的基因组中。然而，产生的重编程细胞的基因组含有病毒DNA，其可能引起有害的遗传后果。许多后续研究通过使用非整合型腺病毒和慢病毒(Sommer 2009Stem Cells 27:543-549)；瞬时表达载体(Okita 2008Science 322；949-953)；和载体序列的靶向整合和切除(Kaji 2009Nature 458:771-775；Woltjen 2009Nature 458:766-770)，来解决这一问题。然而，这些途径仍然涉及病毒、基因整合或DNA质粒载体的使用，因此对于临床应用而言呈现出多种生物学和管理上的障碍。若干研究通过描述无病毒且无DNA的多能重编程方法已经解决了该问题。已将多能重编程因子作为重组蛋白质、合成mRNA和合成miRNA引入(参见，例如Zhou等人,(2009)Cell Stem Cell4:381-384；Warren等人,(2010)Cell Stem Cell 7:618-630；和Miyoshi等人,(2011)Cell Stem Cell 8:633-638)。

两则最近的报道描述了通过将编码定义的转录因子的多种基因的组合导入到小鼠成纤维细胞中使小鼠成纤维细胞直接转化成肝细胞样细胞，而不需首先经过多能的中间态(参见Huang等人,(2011)Nature 475:386-389；以及Sekiya和Suzuki(2011)Nature 475:390-393)。在这些报道中，Huang鉴定了Gata4、Hnf1α和Foxa3的组合(连同p19^Arf的失活)足以诱导鼠肝转化；Sekiya和Suzuki鉴定了诱导鼠肝转化的三种特定的双转录因子组合，包括Hnf4α加Foxa1、Foxa2或Foxa3。如在以上提到的非常早期的重编程研究中，Huang等人以及Sekiya和Suzuki都使用慢病毒或反转录病毒介导的转导以在小鼠成纤维细胞中表达转录因子。然而，尽管已经使用多种非整合型和非基于DNA的方法证实了重编程至多能性(如在以上引用的研究中所描述)，但从未描述过既不使用小鼠细胞也不使用人细胞、不使用重编程因子的整合型慢病毒或反转录病毒介导的递送的一种体细胞向另一类型的直接转化。