[发明专利]植物中内源基因的转录基因沉默

说明书

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求2012年9月7日提交的美国临时专利申请系列号61/698,203的优先权。该申请援引加入本文。

序列表

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表题为2312130PCTSequenceListing.txt，2013年8月26日创建，并且大小为14kb。电子格式的序列表的信息整体援引加入本文。

背景技术

本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默(TGS)。更具体地，本发明涉及能够进行植物、植物组织和植物细胞中内源基因的TGS的核酸构建体。本发明进一步涉及利用本发明的核酸构建体通过TGS减少植物、植物组织或植物细胞中的内源基因表达的方法。

本文中用来说明本发明的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其他材料援引加入本文，并且为了方便，分别分组在参考文献中。

超过十年前，Matzke和同事报道了植物中转基因启动子(NOS)的转录基因沉默(TGS)和启动子DNA上的甲基化之间的关系(Matzke et al.,1989)。从那时开始，对于单子叶植物和双子叶植物中的转基因和内源基因，已广泛研究引起植物中TGS的机制(综述参见(Matzke and Matzke,2004；Eamens et al.,2008；Matzke et al.,2009)。目前TGS的观点提示通过双链RNA加工机器(AGO4、DCL3)产生的21-24nt小RNA(sRNA)靶向具有序列同源性的基因组区。这些sRNA通过DNA甲基转移酶(DRM1/2、MET1、CMT3)的作用指导DNA甲基化，并且推测这之后是涉及组蛋白甲基转移酶和脱乙酰酶的组蛋白修饰，以便建立甲基化基因座处的抑制性染色质状态。

利用转基因作为模式系统的早期研究发现了与植物中TGS相关的一些基本特征。(Mette et al.,2000；Jones et al.,2001；Sijen et al.,2001)这些研究证实需要长发夹结构产生靶向转基因启动子的sRNA。沉默的转基因的DNA分析显示对称和不对称的胞嘧啶甲基化增加，并且MET1参与沉默基因座的维持。相似地，还显示长反向重复序列(IR)介导水稻中35S启动子的高效TGS(Okano et al.,2008)。值得注意的是，正义(S)或反义(AS)方向的单链沉默物在烟草和拟南芥中产生sRNA和产生TGS中是无效的(Mette et al.,2000)。

虽然围绕转基因的TGS的事件的顺序是相对明确的，但是不知道相似的步骤是否也应用于内源基因座(此后为内源基因)的TGS。令人惊讶的是，到目前为止仅报道了几例内源基因座的TGS，它们全部使用IR RNA。Cigan等人(2005)报道了两个玉米内源基因的成功且强的沉默(Mark Cigan et al.,2005)。对于矮牵牛、马铃薯和水稻中的一些内源基因，观察到中等沉默(Sijen et al.,2001；Heilersig et al.,2006；Okano et al.,2008)。在利用模式单子叶植物水稻的综合研究中很好地说明了IR RNA触发内源基因的TGS的无效。有趣的是，水稻中检测的7个内源基因中的6个似乎抗拒通过产生自IR RNA结构的sRNA沉默(Okano et al.,2008)。相比之下，在相同实验中显示35S启动子可以通过靶向该启动子的IR RNA有效沉默。在拟南芥中也报道了其他不成功的试验(八氢番茄红素不饱和酶(PDS)和查耳酮合酶(CHS))(Eamens et al.,2008)。合在一起，这些结果提示内源基因座可能具有一些可以防止不期望的TGS的固有特性；或者，需要探索对内源基因座更有效的沉默策略。除了观察到的在内源基因座处基因沉默的低成功率，内源基因的TGS和DNA甲基化之间以及DNA甲基化和组蛋白修饰之间也有差异(Okano et al.,2008)。对于水稻中的大多数情况，靶向启动子区的IR RNA可以触发同源序列的DNA甲基化，但是它们不能诱导染色质修饰和TGS(Okano et al.,2008)。

需要开发植物中转录基因沉默的核酸构建体和方法。

发明内容