[发明专利]表达序列

说明书

本发明公开了一种编码前导序列的分离的核酸，其具有一特定序列，以及公开了由该核酸编码的分离的前导肽、包括编码前导序列的这种核酸的表达组件，该核酸可操作地连接到编码POI的核酸序列上，本发明公开了一包括该表达组件的重组酵母宿主细胞或载体，一种在该酵母宿主细胞中生产POI的方法，以及进一步地，公开了该特定核酸用于从宿主细胞分泌POI和/或增加来自宿主细胞的POI的分泌的用途。

本发明涉及巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达系统的调节元件，以及它们在生产目标蛋白(POI)的方法中的用途。

背景技术

已在原核和真核宿主中成功实现蛋白分泌。最突出的例子是细菌如大肠杆菌，酵母菌如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，丝状真菌如泡盛曲霉或里氏木霉，或哺乳动物细胞如CHO细胞。尽管一些蛋白可以容易地实现高效率分泌，但是很多其他蛋白仅以相对较低的水平分泌。

基因在宿主生物体内的异源表达需要一载体，允许宿主生物体的稳定转化。该载体或表达组件需为基因提供一功能性启动子，该启动子位于编码序列的5'末端附近。转录因此而受该启动子序列调节和启动。

分泌途径通常开始于跨膜多肽和旨在分泌到内质网(ER)内腔的多肽的易位。为此，这些蛋白具有氨基末端先导序列(precursing sequence)，也被称作“前导序列”，其包含一信号肽和一可选的分泌前导肽原，或由其组成。信号肽通常由13-36个相当疏水的氨基酸组成。信号肽有一个共同的结构：一短的带正电荷的氨基末端区域(n-区域)；一中央疏水区域(h-区域)；和一极性较强的羧基末端区域(c区域)，其中羧基末端区域包含被信号肽酶切割的位点。在ER的内腔侧，信号肽被信号肽酶切除。在通过ER伴侣和折叠酶成功折叠新生多肽后，该蛋白进一步被引导移出ER。这一进程可得到N末端原序列(pro-sequence)的支持，因为其存在于例如酿酒酵母交配因子α(MFα)的前体中。该蛋白然后被运输到高尔基网络并最终到达质膜从而分泌到上清液中。前导肽原(推测)被高尔基内的蛋白酶如酿酒酵母的Kex2蛋白酶从该蛋白上切除。

由于大多数酵母并不分泌大量的內源性蛋白，并且它们的细胞外蛋白质组学目前并未广泛表征，因此，可获得的用于酵母的分泌序列的数量是有限的。因此，采用融合目标蛋白和酿酒酵母的交配因子α前导肽(MFα)的方式来驱动在多种酵母(包括毕赤酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属)中的分泌表达。很可惜，由Kex2蛋白酶进行的MFα蛋白酶解处理经常在产品中产生异源的N末端氨基酸残基。

EP324274B1介绍了在酵母中的改进的异源蛋白的表达和分泌，其采用截短的酿酒酵母α因子前导序列，EP301669B1描述了用于分泌异源蛋白的克鲁维酵母α因子前导序列。

或者，可用酿酒酵母磷酸酶(PHO5，DK3614)、酿酒酵母蔗糖转化酶(SUC，WO84/01153)，以及酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3，EP792367B1)的信号肽用于酵母中的分泌表达。EP0438200(A1)披露了用于在巴斯德毕赤酵母中表达的酿酒酵母SUC2的信号肽序列。

US5268273描述了巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)信号序列，其在大多数情况下弱于MFα。

US7741075描述了用于重组蛋白表达的巴斯德毕赤酵母PIR1分泌信号肽，以及用于重组表面展示的巴斯德毕赤酵母PIR1和PIR2锚定域肽。

Khasa等人2011年(Yeast.28(3):213-26)描述了巴斯德毕赤酵母PIR基因的分离以及在细胞表面展示和重组蛋白分泌方面的应用，尤其是利用PpPir1p蛋白的前原(pre-pro)信号在巴斯德毕赤酵母中进行的重组蛋白分泌，没有与MFα进行对比。