[发明专利]用于生产重组蛋白质的方法

说明书

本发明公开涉及用于增加使用DNA序列稳定转染的宿主细胞数量的方法，其中所述的DNA序列编码目的蛋白质并且能够表达该蛋白质。此外，本发明公开还涉及使用本文所述的方法制备的宿主细胞以及在该方法中使用的多核苷酸序列，例如RNA或DNA，特别是质粒DNA。

背景技术

“经培养的哺乳动物细胞已经成为用于生产临床用途的重组蛋白质的主要系统，由于其具有合适的蛋白质折叠、组装和翻译后修饰的能力。因此，与其他宿主(例如细菌、植物和酵母菌)相比，当蛋白质在哺乳动物细胞中表达时，蛋白质的品质和效力都可以是优异的。

当今，所有重组蛋白质药物的大约60-70％都是在哺乳动物细胞中生产的。此外，估计而言目前有几百种临床候选蛋白质在公司的筹备中。这些蛋白质中，许多都是在永生化的中国仓鼠卵(CHO)细胞中表达的，但是其他的细胞系(例如由小鼠骨髓瘤(NSO)细胞、幼仑鼠肾(BHK)细胞、人胚肾(HEK-293)细胞和人视网膜细胞衍生的那些)也获得了用于重组蛋白质生产的管理机构的批准。尽管用于生物药物生产的大部分当今的哺乳动物细胞培养工艺是基于在悬浮液中培养的细胞，但是人工制造方法的多样性是值得考虑的。

最初，将具有必需的转录调节元件的重组基因转移至细胞中。此外，转移可赋予受体细胞以选择有利性的第二基因。在选择试剂(在基因转移后几天加入)存在下，仅那些表达选择子基因的细胞存活。用于选择的最普通的基因为二氢叶酸还原酶(DHFR)(其为与核苷酸代谢有关的酶)和谷氨酰胺合成酶(GS)。在这两种情况下，在合适的代谢物(在DHFR的情况下为次黄嘌呤和胸苷，在GS的情况下为谷氨酰胺)缺失的情况下发生选择，从而阻止非转化细胞的生长。通常，为了重组蛋白质的有效表达，编码生物药物的基因和选择子基因是否在相同的质粒上表达是不重要的。

在选择后，将存活者以单一细胞的形式转移至第二培养容器中，并且扩增培养物，从而生产克隆群体。最后，针对重组蛋白质的表达来评价单个克隆，其中最高的生产者被保留用于进一步的培养和分析。由这些候选物中选择具有合适生长和生产率特征的一个细胞系用于生产重组蛋白质。然后，建立培养工艺，该工艺由生产需要来确定。至此，所有哺乳动物重组治疗为天然分泌的蛋白质或者由介导蛋白质分泌的基因构建体研发得到。”

上文摘录自2004年出版的Nature综述文章(Florian Wurm Nature Biotechnology Vol 22Number 11November 2004,page 1393-1398)。在2012年，工艺与上文所述的2004年出版的工艺基本上未发生改变。

该Nature Biothechnology综述讨论了随机插入至宿主细胞基因组中的缺点，并且他们声称事实上在转基因插入至细胞基因组的某些部分(例如被称为异染色质的DNA的高度螺旋形式)中的情况下，很少或未获得转基因的表达。

即使在异源基因插入至基因组的允许区域中，例如被称为常染色质的不紧密包装的DNA，相邻的基因仍可以发挥不利的影响，并因此可以使基因灭活。

Nature综述文章中继续宣称：已经研发多种策略来克服随机整合的不利的位置影响。保护性顺式调节元件包含绝缘子、边界元件、支架/基质附着区域、泛染色质开放元件和保守的抗阻遏子元件。具有这些元件的侧翼转基因降低异染色质的影响并允许转基因稳定地表达。用于抑制沉默的另一种方式是使用丁酸酯阻断组蛋白的脱乙酰作用。靶向转基因整合至基因组的转录活性区域是避免位置影响的另一种可能的策略，并且近年来在讨论会上的陈述已经暗示了基因靶向在工业中的用途。”

在本领域中的一些人员致力于靶向整合，有时称为同源重组，但是这需要良好地了解宿主细胞的基因组，并且在没有得到酶的进一步帮助下，这些事件相对少见。

用于制造目的的合适克隆的生成通常需要大量的筛选和费力的寻找，例如可能需要分析1500个克隆以识别适用于表达目的蛋白质的一个克隆。

本发明人意外地建立了使用编码目的蛋白质和NHEJ蛋白质(例如Ku70、Ku80、其组合或其功能片段，或者编码它们的序列)的DNA序列共转染宿主细胞得以产生能够表达目的蛋白质的更多的细胞。

发明概述

因此，提供了使用NHEJ蛋白质或其功能片段，例如Ku70、Ku80、其组合或者编码它们的多核苷酸转染的宿主细胞，其中所述的多核苷酸序列处于合适的启动子的控制之下，并且所述的宿主细胞还被表达盒转染，所述的表达盒包含编码至少一种目的蛋白质的DNA或RNA序列。