[发明专利]针对编码功能蛋白的变体筛选多核苷酸文库

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年9月20日提交的美国临时申请号61/703,566的权益，将其通过引用以其全部内容而特此结合。

关于在联邦政府资助的研究与开发下完成的发明的权利声明

不适用。

发明领域

本发明涉及微生物学、分子生物学和蛋白质生物化学领域。更具体而言，本发明涉及用于对多核苷酸文库分析和富集编码功能蛋白的变体的组合物和方法。

发明背景

对多核苷酸文库筛选编码优选蛋白活性的变体在生物技术中是一项中心事业(参见例如，雅克尔和希尔韦特(Hilvert)，生物技术当前述评(Curr Opin Biotechnol)21，753-759(2010))。遗憾地，随着文库多样性增加，在文库中活性变体的数目呈指数下降(参见例如，郭(Guo)等人，PNAS(2004)；布洛姆(Bloom)等人，PNAS(2005))。这种相反的关系导致多核苷酸文库的筛选无效且昂贵。由于仅仅文库的一小部分编码功能蛋白，因此通常必须筛选数千、数百万或甚至数十亿的变体，以便鉴定所希望的克隆。筛选通常是缓慢且昂贵的，因为它典型地需要自定义的宿主细胞转化、蛋白质表达和频繁纯化与定量、与底物或配体进行特异反应、信号检测与定量。

为有助于文库筛选尝试，已经研发了许多方法和大量的机器人自动化(参见例如，迈尔克(Maerkl)，生物技术当前述评(Curr Opin Biotechnol)22，59-65(2011)；戈达德(Goddard)和雷蒙德(Reymond)，生物技术当前述评15，314-322(2004)；瓦勒尔(Wahler)和雷蒙德，生物技术当前述评12，535-544(2001))。尽管如此，但是筛选通量是不足的且仍是昂贵的，因为必须从庞大的可能性中鉴定有希望的变体。例如，在一个100-氨基酸蛋白中突变两个随机氨基酸形成包含1.98×10⁶个独特成员的文库(参见例如，迪特里希(Dietrich)等人，生物化学年鉴(Ann Rev Biochem)79，563-590(2010))。所有筛选途径的中心局限在于，它们必须针对靶蛋白与特异反应物的活性或相互作用并且针对检测与分离阳性变体的手段两者进行自定义。

发明概述

在不同方面中，在此考虑的本发明或多个发明可以包括但无需局限于以下实施例中的任何一个或多个。

实施例1：一种针对可能编码功能多肽的多核苷酸而对多个多核苷酸进行富集并对该富集的多个多核苷酸进行筛选的方法，该方法包括：(a)提供编码一种多肽的变体的多个多核苷酸，其中这些多核苷酸中的至少一些编码一种具有至少一种活性的多肽；(b)从这些多核苷酸产生多肽；(c)确定这些多肽是否可溶；(d)选择编码可溶性多肽的多核苷酸，以形成富集的多个多核苷酸；并且(e)针对编码具有该活性的多肽的多核苷酸筛选该富集的多个多核苷酸。

实施例2：如实施例1所述的方法，其中所述选择产生编码一种具有该活性的多肽的多核苷酸的至少2倍富集。

实施例3：如实施例2所述的方法，其中所述选择产生编码一种具有该活性的多肽的多核苷酸的至少选自下组的富集程度的富集，该组由以下各项组成：5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁸倍以及10⁹倍。

实施例4：一种关于可能编码功能多肽的多核苷酸的水平来比较至少两个多核苷酸文库的方法，该方法包括：(a)提供编码相同多肽的变体的多核苷酸的至少两个不同文库；(b)针对每一多个多核苷酸：(i)从这些多核苷酸产生多肽；并且(ii)确定这些多肽是否可溶；并且(c)将具有最高水平的可溶性多肽的多个多核苷酸鉴定为包含最高水平的可能编码功能多肽的多核苷酸的多个多核苷酸。

实施例5：如实施例4所述的方法，其中每一多个多核苷酸都包括至少一些编码一种具有至少一种活性的多肽的多核苷酸，并且该方法另外包括针对编码具有该活性的多肽的多核苷酸筛选该鉴定的多个多核苷酸。

实施例6：如任何以上实施例所述的方法，其中该方法另外包括针对编码具有高于预定水平的活性的多肽的多核苷酸筛选该富集或鉴定的多个多核苷酸。