[发明专利]线粒体毒性检测

说明书

技术领域

本发明提供了用于药物筛选的新方法。特别地，该方法对于检测物质对线粒体的作用，尤其是药物物质或候选药物物质的毒性或有益作用是有用的。该方法是基于体外活的人线粒体中的测量，但是在尽可能接近体内状态的环境中。该方法还可用于检测物质对线粒体呼吸的影响。

背景技术

在药物开发中，难以估计当在人体中使用时，药物是否会影响产生能量的线粒体。由于如心脏或肝毒性作用，近年来由FDA批准的多种新药随后被撤回。因此，在1994年和2006年之间由FDA登记的新药中，38种药物均由于对肝和心脏的毒性作用被撤回，这是线粒体毒性的典型症状。显然，这些新药通过了批准以前进行的标准毒性检测，并且在用药物治疗了大量患者之后才观察到毒性作用。Dykens&Will(2007)指出，有证据表明，线粒体功能障碍在从市场上撤回的以及再次引入的具有严格限制的多种药物物质的毒性中起作用。

此外，在近几年，线粒体功能已经引起了很大的兴趣，并且通常认为线粒体功能障碍对于大量疾病的发病机制(例如肌肉疾病、神经病变、心肌病、脑病、败血症引起的多脏器功能衰竭)是起作用的因素。

目前，药物候选物的线粒体毒性大部分是在动物和细胞培养物中进行评价，其结果难以转化为未来的人类应用。

因此，存在对于开发用于线粒体毒性的检测(其是敏感的、可重复的、可靠的和容易的，并且其可以用于药物开发的检测)的需要。

发明内容

本发明涉及涉及含有线粒体的人血液成分的方法。开发的方法的优点是体外测量活的人线粒体中的药物毒性(或有益的影响)，但是在尽可能接近体内的环境中。研究了血浆(这提供与体内环境非常接近的关联)中含线粒体的的人血液成分(白血细胞和/或血小板)。因此，所有的缓冲能力、血清白蛋白、电解质、水解酶等在测量期间存在。

该新颖的方法将直接导致人体中真实的毒性血液浓度的评估，这在作为当前使用方法的细胞培养和动物研究中是不可能的。因此，在相比现在显著更早的阶段检测和筛选候选药物物质的人类毒性是可能的。反过来，这将允许在更早的阶段排除有毒的候选药物，从而避免许多动物试验以及将来人的痛苦。这将促进在早期阶段选择候选药物物质，从而降低药物开发的总的时间和成本。

取决于试验的目的，该方法可用于具有不同的设定的不同环境。

因此，根据本发明的方法可用于以下各项，而不将范围限制于此：

1.筛选并选择来自健康个体血液或所谓的血沉棕黄层(buffy coat)(其是血小板和白血细胞的浓缩溶液)的细胞中的早期或晚期阶段的候选药物。

2.检测患者对于已知的线粒体毒物(mitochondrial toxicant)的敏感性。

3.在临床试验中分析线粒体药物毒性。

4.分析预期改善线粒体功能的药物的有益作用。

一种合适的用于筛选和选择候选药物或检测人对作用于线粒体的物质的敏感性(即，上面的项目1和2)的方法是包括以下(步骤)：

i)使分离自人血液样品的含有活线粒体(live mitochondria)的细胞样品进行高分辨率呼吸测量(high-resolution respirometry)

ii)使细胞样品与提高线粒体内膜对质子的渗透性的物质接触，

ⅲ)加入包含介质(载体、媒介物，vehicle)中的检测物质的检测样品，

ⅳ)比较加入检测样品之前和之后的耗氧量(氧消耗)并且比较检测样品耗氧量与介质的对照样品的耗氧量，其中，耗氧量下降表明对线粒体的负面作用，

v)使来自iii)的样品与线粒体复合物I-功能抑制剂，如鱼藤酮接触，以表明依赖于复合物II-底物氧化的细胞呼吸，

和

vi)使来自v)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂，如抗霉素A接触以测定任何非线粒体耗氧活性，如所述样品的自动氧化(auto-oxidation)。

用于筛选和选择潜在的候选药物或用于检测人对具有线粒体作用的物质的灵敏性(即，上面的项目1和2)的替代方案，是研究这类检测物质在复合物II筛选试验中的效果。在图11中示出了这种方法，并且包括：

i)使分离自人血液样品的含有活线粒体的细胞样品进行高分辨率呼吸测量，

ⅱ)使细胞样品与抑制复合物I呼吸的物质接触，

ⅲ)加入包含介质中的检测物质的检测样品，

ⅳ)加入使质膜透化(permeabilize)的物质，

ⅴ)将参比物质加入至iv)中得到的样品，以及