[发明专利]用于检测或测定病毒载体组合物对真核细胞及其所用生物标记的影响的方法

说明书

本发明涉及用于表征在响应病毒载体组合物引入靶细胞时的总体细胞变化的方法和组合物。更具体地讲，它涉及用于评价将转基因转入靶细胞的病毒载体组合物的质量的方法，所述方法包括测定选自以下的至少一种生物标记的表达水平：CXCL2和EREG，和/或选自以下的至少一种生物标记的表达水平：ASPM、AURKB、CENPA、CENPF、CKS1B、E2F8、ERCC6L、FAM83D、KIFC1、MKI67、NEK2、NUSAP1、OIP5、PRC1、RRM2、SGOL1、SPC25、TOP2A和TTK。

本发明一般而言涉及病毒载体介导的基因治疗和重组基因表达领域。更具体地讲，本发明涉及使用一组特定的基因产物(“生物标记”)和它们的差异表达方式(“表达特征”)的方法和组合物，其中所述表达方式关系到病毒载体组合物可能对任何指定靶细胞、尤其是任何指定真核细胞的影响。本发明是基于在病毒载体转导的细胞中差异表达的一组特定的生物标记的鉴定，所述生物标记可用于预测病毒载体组合物的质量，即纯度和/或浓度。该组基因也可用于设计具有改进的治疗功效的特定辅助形式。

基于病毒的载体是常用于将遗传物质递送到细胞中的工具。这样的载体最先开发用作裸DNA转染的备选，用于分子遗传学实验和用于治疗用途例如基因治疗或疫苗。病毒载体分为两个主要类别：将自身插入受体基因组的整合载体，和通常形成染色体外遗传元件的非整合载体。整合载体例如γ-逆转录病毒载体(RV)和慢病毒载体(LV)是稳定遗传的。非整合载体，例如腺病毒载体(ADV)和腺伴随病毒(AAV)载体从迅速分裂的细胞中快速丢失。

具体地讲，逆转录病毒载体源自属于逆转录病毒科(Retroviridiae)的病毒，其包含具有复杂大分子结构的包膜RNA病毒，流体动力学直径大约150nm (Salmeen等人，1975)。因为具有大尺寸，所以病毒颗粒具有低扩散率(10-8 cm²/s)；经蔗糖梯度超速离心测定，它们的密度为大约1.15-1.16 g/cm3 (Coffin等人，1997)。它们由60-70%蛋白、30-40%脂质(源自生产细胞的质膜)、2-4%碳水化合物和1% RNA组成(Andreadis等人，1999)。逆转录病毒颗粒由两个相同拷贝的单链正义RNA加上整合酶和逆转录酶组成，包含在由脂质双层膜围绕的蛋白衣壳内。脂质双层上镶有糖蛋白突起。逆转录病毒载体在广泛pH范围内是带负电荷的颗粒，因为它们的等电点在非常低的pH值。包膜蛋白和脂质双层可能是病毒表面带负电荷的主要贡献者(Rimai等人，1975)。

对于药物发现的体外应用，对于体内和离体临床测定，对于基因治疗和动物模型开发，基于病毒的载体的使用已经成为关键的递送方法。慢病毒载体，例如HIV-衍生的载体，目前是用于体外和体内基因转移的优选工具，因为它们能够转导无限增殖化细胞或原代细胞(两者是休眠细胞或增殖细胞)，并且导致转基因在基因组中的稳定整合。这些优势使它们不仅在治疗情况下以及在功能基因组学中是有价值的工具，而且用于生产人用的目标分子。近期在肾上腺脑白质营养不良(N. Cartier, S. Hacein-Bey-Abina,等人，2009)或人β-地中海贫血(Marina Cavazzana-Calvo等人，2010)的治疗中获得的成功，已经证实了这样的载体在基因治疗中使用的益处。

在再生医学中的近期研究也使用基于病毒的载体，尤其是用于产生和分化诱导的多能干细胞(iPS) (Sommer等人，2009)。尽管有可能使用天然载体组合物将体细胞重新编程到iPS (Takahashi K.和Yamanaka S. 2006)，但是纯化的和浓缩的载体组合物用于重新编程，导致收率和克隆存活和质量的较大提高(Vallier等人，2009)。此外，基于病毒的载体通常用于产生细胞模型，作为治疗性靶标验证的一部分用于药物开发和治疗用的重组蛋白的生产。在这种情况下，有必要良好表征通过基于病毒的载体的转导的细胞诱导的改变。正如Banito A等人(2009)证明，细胞操纵例如细胞重新编程，可以是缓慢和随机的，表明存在着障碍，限制了其效率或稳定性。在此，他们鉴定了衰老作为一个这样的障碍并且证明了不同衰老效应器的消融改进了重新编程的效率。为此，纯化的载体允许避免基于病毒的载体组合物对靶细胞的任何不利影响。