[发明专利]低温下β‑葡萄糖苷酶活性增强的多肽

说明书

由于大量原料的可利用性和对乙醇作为燃料的兴趣，用纤维素生产乙醇的可能性已经得到很大的关注。用于这类工艺的基于纤维素的天然原料被称为“生物质”。已经将许多类型的生物质，例如木材、农业废弃物、草本作物和城市固体垃圾，考虑作为生产生物燃料的潜在原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。

纤维素是由β-1,4键连接的葡萄糖分子组成的聚合物，其对降解或解聚合非常有耐性。一旦纤维素被转化为葡萄糖，后者容易用酵母发酵成生物燃料，如乙醇。

研究的用于将纤维素转化为葡萄糖的最古老的方法是基于酸水解。该工艺可以在浓酸或稀酸的存在下进行。然而，几个缺点(例如当使用浓酸时酸回收很少，以及使用稀酸的情况下葡萄糖的产量低)对于酸水解工艺的经济性是不利的。

为了克服酸水解工艺的缺点，最近的纤维素转化工艺已经更多地与酶促水解(使用纤维素酶类型的酶)相关。然而，该木质纤维素生物质(如纤维素)的酶促水解的缺点是其工业生产方法较为昂贵。因此，有必要使用越来越有效的分泌纤维素酶的微生物菌株。在这方面，很多微生物包含水解纤维素的酶，例如真菌-木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、或镰刀菌属(Fusarium)，以及细菌例如高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。由这些微生物分泌的酶具有用于将纤维素转化为葡萄糖的三种类型的活性，分为三组：随机攻击纤维素纤维内部的内切葡聚糖酶，攻击纤维末端释放纤维二糖的外切葡聚糖酶，和将该纤维二糖水解为葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。后者构成了纤维素转化过程的限制性步骤。实际上，该过程的第一个难题是纤维二糖到葡萄糖的转化，因为在生物燃料的生产过程中，任何在该过程最后没有被水解的纤维二糖代表了产量的损失。

考虑到一些生产纤维素酶的微生物(包括木霉属)产生非常少的β-葡萄糖苷酶，纤维二糖的积累是酶促水解的一个主要问题。实际上，由工业木霉属菌株分泌的总蛋白的不到1％是β-葡萄糖苷酶类型。因此，这样少量的β-葡萄糖苷酶导致了将纤维二糖水解为葡萄糖的低容量，从而造成在系统中纤维二糖的积累。高浓度的纤维二糖碰巧抑制其他纤维素酶，尤其是抑制其反应终产物是纤维二糖的外切葡聚糖酶的活性。为了克服这些缺点，发明人在他们的专利申请WO2010/029259中开发了β-葡萄糖苷酶基因使其能够获得具有增加的比活性的酶，从而大幅度改进将木质纤维素生物质转化为生物燃料的工艺。

水解和发酵可以根据各种方案进行。最常见的由独立的水解和发酵(SHF)组成。该方法能够通过维持最佳反应条件来优化各个步骤。发酵在约28℃至约30℃之间的温度即时进行，而水解一般在至少45℃的温度进行。然而，在SHF中，在反应最后释放的糖浓度非常高，导致对酶的抑制，降低了该方法的效率。

为了避免这些缺点，可以设想另一种方法(SSF-同时糖化和发酵)。在SSF中，两个步骤(己糖的水解和发酵)同时发生，防止糖积累到抑制酶的浓度。使用单一反应器后，投资成本也降低了。由于没有抑制，之后水解度就提高了，因为释放的糖立即被用于发酵成乙醇。

在该方法中，反应器的温度必然由水解和发酵的最佳温度之间的平衡构成，一般在约30℃至约35℃之间。然而，纤维素分解酶(包括β-葡萄糖苷酶)的活性在该温度被降低了约30％。

因此，需要在SSF方法的最佳水解和发酵温度下，尤其是在约30℃至约35℃之间的温度下能够保持有效的β-葡萄糖苷酶活性的酶。

发明人已经开发了在约30℃至约35℃之间的温度下具有增强的β-葡萄糖苷酶活性的多肽，尤其是与野生型BGL1蛋白(序列SEQ ID NO：3)的β-葡萄糖苷酶活性相比。BGL1是来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的β-葡萄糖苷酶。

发明人之前已经鉴定出与野生型BGL1蛋白的β-葡萄糖苷酶活性相比具有增强的特异性β-葡萄糖苷酶活性的几个克隆。该结果展示于他们的专利申请WO2010/029259中。更具体地，他们已经说明了编码SEQ ID NO：5的多肽的一个具体克隆(称为100B11)，在里氏木霉中该克隆在强启动子控制下的表达导致了产生的酶鸡尾酒与由没有表达该酶的菌株产生的酶鸡尾酒相比，其β-葡萄糖苷酶活性提高了26.2倍(专利申请WO2010/029259表6)。