[发明专利]使用必需基因作为标记并任选地将其再循环的细胞修饰方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于在靶位点修饰宿主细胞的方法。本发明还涉及通过这种方法能够得到的宿主细胞。本发明还涉及使用根据本发明被修饰的带有目的核酸的细胞来生产目的生物化合物的方法。

发明背景

微生物(例如真菌或酵母)的转化是增强、引入或改变特定性状的公知程序。为了这个目的，可以使用外源和內源DNA序列二者。因为转化并非100％有效，因此使用标记基因来选择被转化菌株，即含有期望性状的个体。标记基因是被引入DNA的一部分，其赋予被转化菌株可被选择的新的属性。普遍使用的标记的实例是抗生素或其它有毒化合物抗性基因、解除营养缺陷的基因或参与某化合物的代谢的基因。

使用标记基因的成功率不同。阻碍成功的因素包括：1)真正被转化的菌株消耗来源于培养基的抗生素/有毒化合物，从而允许未被转化的菌株生长；和2)必需成分的互养(cross-feeding)。这些因素引起背景生长，因此需要多轮纯化以获得纯的被转化菌株。这个过程可以是耗时的。此外，对于某些种类的选择标记(例如营养缺陷型标记或参与代谢的标记)，必须使用限定培养基来选择被转化菌株。与非限定生长培养基相比，这些限定培养基常常减缓生长。

真菌常常显示多核，这阻碍选择其中所有核具有相同基因型的细胞。这要求多轮选择，经常经由孢子形成期以鉴定单核区(single-nuclei stadia)，这是耗时的。

此外，通常需要从菌株中移除标记基因以用于商业发酵。这种移除可导致意料之外的基因型和/或表型效果。

当以微量滴定板方式进行高通量(HTP)转化时，背景生长的最小化变得甚至更加困难。适用于这个目的的标记较少，而且由于微孔中的有限生长区域，选择剂的消耗或互养是常见的。通常地，应用选择平板，但自动化可受益于在液体培养基中选择，而这在选择剂的消耗或互养发生时是不可能的。

因此，这些作用严重阻碍了HTP转化的效率。

发明简述

本发明涉及修饰生物体的方法。该方法可被用于，例如敲除基因或者向生物体中转移任何期望的一种或多种核酸。换言之，该方法可被用作转化生物体的方法。

本发明基于必需基因(essential gene)的使用，必需基因即具有以下功能或编码以下功能的一种或多种核酸，即没有所述功能的个体细胞无法生存或可不分裂(在细胞被暴露的特定条件下)。这种基因可被用于通过必需功能的回补(complementation)进行选择。这种基因的使用确保仅存活菌株是含有回补的必需功能的那些，因此背景生长被减轻。

本文中，具有以下功能或编码以下功能的一种或多种核酸可被称为必需核酸，即没有所述功能的个体细胞无法生存或可不分裂/复制(在细胞被暴露的特定条件下)。必需核酸可以是单一核酸。然而，可以以下述方式实施本发明，其中两种或更多种核酸合起来具有或编码必需功能。

为了能够使用必需基因作为选择标记，通常首先使这个基因在宿主基因组中失活，即致使其无功能，例如通过缺失。存在一些敲除必需基因表达的方法，例如利用siRNA沉默、抑制启动子活性、形成突变、从染色体中部分或完全移除或者重排必需基因DNA。在本发明中，通常使用不同的方法来敲除必需基因。

特别地，用被选择的必需基因的精确拷贝或其变体，或者用一个或多个基因来完全或部分替换被选择的必需基因，其中所述一个或多个基因合起来可替换由被替换基因编码的必需功能。

这种替换(必需)基因与位点特异性重组位点一起被提供，其中所述位点特异性重组位点能够被重组酶(例如酪氨酸重组酶，例如Cre-重组酶)识别。替换(必需基因)可位于两个位点特异性重组位点之间。

编码重组酶的核酸也可通过质粒被提供，例如位于相同重组位点之间(以使它将在重组酶的诱导和表达之后被缺失)或者位于基因组的其它地方，或通过瞬时表达被提供。

重组酶编码核酸可受诱导型启动子的控制而表达，因此启动子被诱导之后，重组酶产生。

重组酶被选择以使它能够识别位点特异性重组位点，且位点特异性重组位点被放置以使，在重组酶存在时，重组发生从而使“替换”必需基因变得无功能。位点特异性重组位点通常将位于替换必需基因的两个位点(即“上游”和“下游”)以使替换必需基因被整体缺失(在重组酶存在时)。