[发明专利]使用必需基因作为标记并任选地将其再循环的细胞修饰方法

权利要求书

1.在靶位点修饰宿主细胞的方法，所述方法包括：

通过用其侧翼是至少两个位点特异性重组位点的具有必需功能或编码具有必需功能的产物的核酸的拷贝替换宿主细胞中具有必需功能或编码具有必需功能的产物的内源核酸的步骤提供宿主细胞，所述宿主细胞在第一位点包含至少两个位点特异性重组位点和具有必需功能或编码具有必需功能的产物的核酸，其中在所述第一位点，至少两个所述位点特异性重组位点位于具有必需功能或编码具有必需功能的产物的所述核酸的侧翼；

在靶位点向所述宿主细胞中引入具有所述必需功能或编码具有所述必需功能的产物的另一核酸；以及

通过所述至少两个位点特异性重组位点在所述第一位点实施重组，以使所述第一位点处具有必需功能或编码具有必需功能的产物的所述核酸无功能，

其中目的核酸被引入到靶位点，

从而在所述靶位点修饰所述宿主细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中在所述靶位点向所述宿主细胞中引入具有所述必需功能或编码具有所述必需功能的产物的所述另一核酸导致所述靶位点的核酸序列丢失。

3.根据权利要求1的方法，其中至少两个所述位点特异性重组位点位于编码重组酶的序列的侧翼，其中所述重组酶识别至少两个所述位点特异性重组位点。

4.根据权利要求1的方法，其中所述重组酶是酪氨酸重组酶。

5.根据权利要求3的方法，其中所述重组酶的表达受诱导型启动子的控制。

6.根据权利要求1的方法，其中所述必需功能是真菌中的必需功能。

7.根据权利要求1的方法，其中同时、分别或顺次地实施以下：

在靶位点向所述宿主细胞中引入具有所述必需功能或编码具有所述必需功能的产物的另一核酸；和

通过所述至少两个位点特异性重组位点在所述第一位点实施重组，以使具有必需功能或编码具有必需功能的产物的所述核酸无功能。

8.根据权利要求1的方法，其中所述必需核酸的另一拷贝和至少两个位点特异性重组位点一起被引入到所述靶位点。

9.根据权利要求8的方法，其还包括：

在第二靶位点向所述宿主细胞中引入具有所述必需功能或编码具有所述必需功能的产物的所述核酸的另一拷贝，所述序列任选地和至少两个位点特异性重组位点一起被引入；和

通过所述至少两个位点特异性重组位点在第一靶位点实施重组，以使具有必需功能或编码具有必需功能的产物的所述核酸无功能。

10.根据权利要求9的方法，其包括一个或更多个另外的下述循环：

在另外的靶位点向所述宿主细胞中引入具有所述必需功能或编码具有所述必需功能的产物的所述核酸的另一拷贝，所述序列任选地和至少两个位点特异性重组位点一起被引入；和

通过必需基因侧翼的所述至少两个位点特异性重组位点的重组使在之前的引入循环中引入的具有必需功能或编码具有必需功能的产物的所述核酸无功能。

11.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞的同源重组(HR)效率提高。

12.根据权利要求1的方法，其在液体基质中实施。

13.根据权利要求1的方法，其中所述目的核酸编码目的生物化合物或参与合成目的生物化合物的化合物。

14.用目的核酸转化宿主细胞的方法，所述方法包括：

通过用其侧翼是至少两个位点特异性重组位点的具有必需功能或编码具有必需功能的产物的核酸的拷贝替换宿主细胞中具有必需功能或编码具有必需功能的产物的内源核酸的步骤提供宿主细胞，所述宿主细胞在第一位点包含位于具有必需功能或编码具有必需功能的产物的核酸侧翼的至少两个位点特异性重组位点；

在第二位点向所述宿主细胞中引入目的核酸和具有所述必需功能或编码具有所述必需功能的产物的另一核酸；和

通过所述至少两个位点特异性重组位点的重组移除位于所述第一位点的具有所述必需功能或编码具有所述必需功能的产物的所述核酸，

从而用目的核酸转化所述宿主细胞。

15.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是原核、古细菌或真核细胞。

16.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。