[发明专利]设计趋异的密码子优化大重复DNA序列的方法

说明书

优先权声明

本申请要求获得于2012年6月16日提交的题为“设计趋异的密码子优化大重复DNA序列的方法”的美国临时专利申请系列号61/672,114的申请日的权益。

技术领域

本公开一般地涉及用于优化基因表达的方法。在特定的实施方案中，本公开涉及优化具有氨基酸重复结构域的基因产物的表达的方法。

背景

由于化学DNA合成技术的进步，全基因合成的费用已经变得往往比试图从其天然来源克隆基因更具有成本优势。因此，在植物转化和其他生物技术领域中，计算机辅助设计编码有价值蛋白质的合成DNA序列日益重要。

遗传密码由称作密码子的三核苷酸单位构成。有64种可能的密码子，每一种密码子指定20种氨基酸中的一种，或者指定翻译的结束(“终止密码子”)。因此，至少有一些密码子是冗余的。在绝大多数生物所使用的编码系统中，有两种氨基酸分别是由单种密码子编码的，而所有其它的氨基酸则分别由2、3、4或6种密码子编码，还有3种终止密码子。对于由2、3或4种密码子表示的氨基酸，密码子之间的差异在于第三位核苷酸。对于由2种密码子表示的氨基酸，两者的第三位均是嘌呤(A,G)或嘧啶(C,T)。对于三种由6种密码子表示的氨基酸(Arg,Leu,和Ser)，每一种具有一组由4个密码子构成的组，这些密码子遵循上述在第三位变异的模式，再加上一个由2个密码子构成的组。Arg和Leu各自由一个二密码子组表示，两个密码子的第一和第二位核苷酸不同。丝氨酸(Ser)的二密码子表示(two-codon representation)与Arg的二密码子组的差异仅在于第三位核苷酸。

对于特定的某种氨基酸而言，给定的生物对各种可能的密码子的使用不是均等的。生物各有各的密码子使用偏好。密码子使用偏好的模式对于生物及其近亲而言在整个基因组上是独特的。例如，在链霉菌中，常见的密码子一般在第三位包括G或C。稀有的密码子一般在第三位包括A或T。在其他生物中，第三位优选的是A或T。在特定的物种中，根据其自身的密码子偏好，可以有截然不同的基因类别。例如，在大肠杆菌中大概有三类基因，每一类具有截然不同的密码子使用标志(signature)。一类富含被大量表达的重要蛋白质；第二类包括以相对低水平表达的蛋白质；而第三类包括很可能是新近从其他物种中获得的蛋白质。

在大多数人造基因设计策略中，过程试图使人造基因的密码子组成与待表达该人造基因的宿主的基因密码子组成相匹配。参见例如美国专利公开No.US2007/0292918A1。这样的策略在一些情况下可能导致人造基因在宿主中的表达增加。例如，酵母中的密码子优化可能显著提高异源基因转录本的翻译，其原因是使得例如氨基酰-tRNA限制和富含AT序列处的转录终止等效应的最小化。参见例如Daly and Hearn(2004)J.Mol.Recognition 18:119-38。

然而，尽管在本领域中普遍共识需要一定的密码子优化，但是从业人员对于用于优化的一般策略尚未达成统一意见。一些人的首选策略是在设计异源基因过程中尽可能多地使用表达宿主物种中的常用密码子。另一种为另一些人首选的策略对特定的密码子的上下文给予最大的重视，从而令表达宿主中频繁出现的密码子对的使用最大化。第三种策略是使新物种中的新编码序列的密码子用法与原始物种中的参考编码序列的密码子用法相似。该第三种策略非常强调要认识到可能需要稀有密码子来确保转录本RNA分子的适当二级结构。进一步的策略是使异源基因的密码子组成与新宿主表达基因的总体密码子组成相似。此外，仅使用在异源序列中以相同频率反复出现的密码子，最终获得的效果可能与选用稀有密码子相同；例如过度使用相应的tRNA会限制该tRNA的可得性。人们在尝试对基因序列的密码子进行优化以用于在宿主生物中表达时，必须平衡这些策略及其潜在的考虑，以便实现特定的方法学。