[发明专利]外膜囊泡

说明书

本发明提供了来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡(OMV)，该OMV包含在其腔中游离的至少一种异源蛋白，其中当给予哺乳动物时，该OMV能够引发针对该异源蛋白的免疫应答。本发明还提供了用于制备本发明的OMV的方法，包含本发明的OMV的药物组合物，尤其是免疫原性组合物和疫苗，以及使用OMV在哺乳动物中产生抗体免疫应答的方法。

本申请请求2012年9月18日提交的美国临时申请US61/702,296和2013年3月15日提交的美国临时申请US61/799,311的权益，这两项申请的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

技术领域

本发明涉及来自革兰氏阴性细菌的囊泡。囊泡包含存在其腔中的异源蛋白。该囊泡特别有用于免疫原性组合物，例如疫苗。

背景技术

由于细胞被膜的膨压，革兰氏阴性菌可在其生长期间自发释放外膜囊泡(OMV)。可通过某些细菌组分的破坏来促进这类OMV的形成，例参考文献1和2中破坏了大肠杆菌Tol-Pal系统以得到在生长期间向培养基释放囊泡的菌株。也可通过破坏完整的细菌来产生OMV。已知的OMV生产方法包括使用去污剂处理(例如，用脱氧胆酸盐)[3和4]，无去污剂方法[5]或声处理[6]等的方法。

OMV在免疫原性细胞表面相关的、周质和分泌的抗原中富集，并且已经用作例如针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组B的疫苗[7]。它们特别适于该用途，因为囊泡含有发挥佐剂作用的化合物，这引发针对该抗原的强免疫应答。从而对于免疫系统而言，囊泡是比纯化的抗原性蛋白质或其他细菌组分更为接近的天然细菌模拟物。OMV因此保持疫苗和其他免疫原性组合物的更具吸引力的靶标。已经提出，通过使用ClyA作为融合伙伴对OMV进行工程改造以在OMV表面上呈现多种抗原能够增加一些蛋白质抗原的免疫原性[8]。

已经进行了多次尝试以使异源蛋白，尤其是异源抗原靶向OMV。然而，很大程度上因为与异源蛋白质向囊泡运输相关联的挑战，迄今为止，相对亲本细菌而言外来的抗原仍然在大部分OMV中显著缺失[11]。大多数使异源蛋白靶向OMV的尝试依赖于异源蛋白与整合膜蛋白的共价连接。这类共价连接的异源蛋白的示例包括FLAG表位与OmpA(外膜蛋白A)的全长序列的融合物、FLAG表位与PagP(PhoPQ-激活基因P)的全长序列的融合物[9]以及GFP与ClyA(溶细胞素)的融合物[10]。凭借它们与膜蛋白的共价连接，所得的融合蛋白靶向外膜并且因此包含于OMV中。这些方法具有缺陷，尤其是由于难以在不对转化的细菌造成有害影响的情况下过表达大量的整合膜蛋白。

还已证明，难以使周质蛋白靶向OMV。GFP与Tat(双精氨酸转运体)信号序列的融合导致靶向周质的GFP的过表达，但是GFP荧光几乎没有超过OMV中的背景荧光水平[11]，表明GFP没有进入OMV中或者由于错误折叠而在OMV中没有功能。

仍然存在对开发适于在OMV中表达异源蛋白的方法，尤其是在OMV中表达抗原性蛋白质的方法的需求。也仍然存在对替代或改良的OMV(尤其用于疫苗)的需求。

发明内容

发明人已经发现使异源蛋白靶向OMV的腔克服了许多与使异源蛋白靶向OMV的膜相关的问题。令人惊讶地，发明人也已经发现当给予哺乳动物时，腔中含异源蛋白的OMV能够引发针对该蛋白质的免疫应答。

因此，本发明提供了来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡(OMV)，其中该OMV包含在其腔中游离的至少一种异源蛋白，并且当给予哺乳动物时，该OMV能够引发针对该异源蛋白的免疫应答。

本发明也提供了制备本发明的OMV的方法，该方法包括在革兰氏阴性细菌的周质中表达异源蛋白的步骤。本发明还提供通过该方法获得的或可通过该方法获得的OMV。

本发明也提供包括(a)本发明的OMV和(b)药学上可接受的运载体的药物组合物。