[发明专利]用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法

说明书

交叉引用

本申请要求2012年6月18日提交的美国临时专利申请序列号61/661,293的优先权，该临时专利申请通过引用整体并入本文。

背景技术

下一代测序(NGS)文库是其核苷酸序列有待测定的DNA片段的集合。用于插入到这些文库中的DNA的来源通常为已被片段化为期望长度的基因组DNA或者来自给定细胞群体的转录组的拷贝。转录组文库的产生是通过制备RNA群体的cDNA拷贝，产生每条DNA链的互补链，从而生成双链DNA，然后将双链DNA连接至文库特异性衔接子进行的。可通过使用随机引物、序列特异性引物或含有寡聚dT尾的引物引发聚腺苷酸化的转录物群体来合成cDNA。常见地，这些片段群体包含并非特定研究所关注的DNA，并且在一些情况下，这些非期望的DNA序列占到整个DNA群体的非常显著的百分比。例如，在全转录组研究中，在不存在从样品中去除rRNA的步骤下，核糖体RNA(rRNA)序列构成典型cDNA文库中的所有片段的大多数(60-90％)。在另一实例中，来自外周血的基因表达概况分析(profiling)主要涉及来自外周血单核细胞(PBMC)的mRNA，PBMC占全血样品的不到0.1％。减少来自占血液样品中细胞的大多数的红细胞的珠蛋白RNA在此类测定中是期望的。

关于rRNA去除或排除，已描述了三种通用的方法：1)从起始群体中去除rRNA；2)采用寡聚dT引物进行差别性引发(即仅引发聚腺苷酸化的转录物)；以及3)在与rRNA序列互补的引物在引物集合体中被特异性消除(或代表不足)的情况下进行差别性引发(非完全随机(Not-So-Random)或NSR引物方法；参见Armour等人，2009)。基于以下两个原因，用仅识别poly(A)-序列的引物来引发总RNA群体是有问题的。首先，其不能用于原核生物，因为原核mRNA在其3’端不含poly(A)-序列。其次，即使对于真核RNA样品，许多生物学上重要的元件，如调节性转录物，是未经聚腺苷酸化的，因此从寡聚dT引发的文库中丢失。尽管NSR引发策略在设计用于特定生物体时可能是有效的，但当在更宽范围的样品类型中使用一组优化不足的引物时，NSR引发可引起样品群体的失真。

需要用于从NGS文库中去除特定的非期望DNA片段的改进的方法。这样的方法理想地会使得能够使用无偏模板群体开始并在产生NGS文库后以序列特异性方式消除非期望的DNA片段。本文所述的发明满足了这一需求。

发明内容

本发明提供了用于构建NGS文库的新的方法、组合物和试剂盒，在该文库中非期望的核酸序列已被排除或大幅度减少。特别地，本发明的一个重要方面是允许在产生NGS文库之后以序列特异性方式消除或减少非期望的DNA序列的方法和组合物，在该NGS文库中起始核酸序列群体(例如，转录组)的所有序列以未失真的、无偏的方式表现。本发明的方法可用于从核酸文库中消除非期望的核酸序列，如核糖体RNA，并因此可用于富集文库中的目的核酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种以序列特异性方式从具有单链DNA模板的核酸文库中选择性地去除非期望的核酸序列的方法。在一些实施方案中，该方法包括：a)使一个序列特异性寡核苷酸引物或一组序列特异性寡核苷酸引物与在每个末端附接有固定取向的衔接子的单链DNA模板退火，其中该序列特异性寡核苷酸被设计为互补于非期望的核酸序列或与非期望的核酸序列相邻的区域，并且其中两个衔接子序列中的一个包含对双链DNA具特异性的限制性内切核酸酶的识别序列；b)用DNA聚合酶将序列特异性引物延伸至衔接子-DNA模板连接点之外，从而产生双链DNA片段，其中寡核苷酸引物与单链DNA模板互补；c)用对双链DNA具特异性的限制性内切核酸酶处理DNA片段(单链的和双链的)的群体，从而仅在衔接子限制性内切核酸酶位点裂解双链DNA片段，并因此从包含非期望核酸序列的片段的一个末端去除衔接子；以及d)使用对每种衔接子均具有特异性的引物进行PCR，由此仅当片段在同一模板上具有两个PCR引发位点时才发生指数式扩增，从而仅扩增所期望的核酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种用于从目的样品构建核酸文库、同时保留无偏核酸模板群体的方法，在该无偏核酸模板群体中起始核酸序列群体的所有序列均得到表现。