[发明专利]用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法

权利要求书

1.一种用于从核酸文库中排除或减少特定的非期望的核酸序列的方法，该方法包括：

a.生成包含单链DNA片段的核酸文库，该单链DNA片段在每个DNA片段的每个末端附接有固定取向的衔接子；

b.使序列特异性寡核苷酸探针与所述在每个末端附接有固定取向的衔接子的单链DNA片段退火，其中该序列特异性寡核苷酸探针被设计成与所述非期望的核酸序列互补，并且其中两个衔接子中的至少一个包含对双链DNA具特异性的限制性内切核酸酶的识别序列；

c.用DNA聚合酶延伸所述序列特异性寡核苷酸探针，从而生成包含所述非期望的核酸序列的至少一部分的双链DNA片段；

d.用对双链DNA具特异性的限制性内切核酸酶处理包含双链和单链DNA的DNA片段群体，从而在限制性内切核酸酶位点处裂解双链DNA片段；以及

e.用一组对所述衔接子序列具有特异性的引物进行PCR，从而扩增包含期望的核酸序列的DNA片段。

2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括对扩增产物进行测序的额外步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸文库来源于分选的细胞的群体。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸文库来源于单细胞。

5.如权利要求3所述的方法，其进一步包括将细胞分选到多孔板、微阵列、微流体装置或载玻片中，由此产生分选的细胞的群体。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述分选根据细胞表面标志物来进行。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述分选根据细胞的光学性质来进行。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述分选根据细胞大小来进行。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述非期望的核酸序列包含细菌核糖体RNA、线粒体DNA、人珠蛋白mRNA、人细胞质rRNA、人线粒体rRNA、葡萄细胞质rRNA、葡萄线粒体rRNA或葡萄叶绿体rRNA。

10.如权利要求1所述的方法，其中步骤d.的限制性内切核酸酶是BspQI。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶包括热启动聚合酶。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述DNA聚合酶是MyTaq聚合酶。

13.如权利要求1所述的方法，其中步骤a.包括以下步骤：

i.对RNA样品进行逆转录；

ii.由逆转录的RNA样品生成双链cDNA，其中四种dNTP中的至少一种即dATP、dCTP、dGTP或dTTP在第二链合成过程中被非规范dNTP所替代，并掺入到第二链中；

iii.对双链cDNA进行末端修复；

iv.将衔接子连接到所述双链cDNA的5’端，其中衔接子链中的一条具有掺入到所述衔接子的连接链中的非规范核苷酸；

v.进行缺口修复；以及

vi.用裂解剂选择性去除所述第二链。

14.如权利要求5所述的方法，其中所述非规范核苷酸包含尿苷或肌苷。

15.如权利要求13所述的方法，其中步骤vi包括裂解一种或多种非规范核苷酸的碱基部分，从而形成脱碱基位点。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述裂解剂包含糖基化酶。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述糖基化酶是UNG或UDG。

18.如权利要求13所述的方法，其中所述裂解剂包含伯胺。

19.如权利要求13所述的方法，其中所述裂解剂包含多胺。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述多胺是DMED。

21.如权利要求13所述的方法，其中所述裂解剂包含糖基化酶和多胺。

22.如权利要求13所述的方法，其中所述裂解剂包含内切核酸酶V。