[发明专利]单细胞的多转录物的高通量测序

说明书

本申请要求2012年6月15日提交的美国临时申请号61/660,370的优先权权益，所述案的所有内容以引用的方式并入本文中。

发明背景

1.发明领域

本发明大体上涉及分子生物学和免疫学的领域。更具体地说，本发明涉及用于高通量分离cDNA编码免疫细胞受体和抗体的方法。

2.相关领域的描述

存在对以高通量从单个细胞鉴别两种或更多种转录物的表达的需要。具体地说，对于许多生物技术和医学应用来说，以极高通量从单个细胞鉴别并且测序编码包括适应性免疫受体的两条链的基因对以准确测定表达于患者或实验室动物中的免疫受体的完整组库是重要的。由B淋巴细胞和T淋巴细胞表达的免疫受体分别由VH和VL抗体基因以及由TCRα/β或γ/δ链基因编码。人具有基于表面标志(CD蛋白)和转录因子(例如Treg T淋巴细胞亚群的FoxP3)的表达被分类成不同亚群的数万或数百万种不同的B淋巴细胞和T淋巴细胞。高通量DNA测序技术已用以测定相关于具体疾病状态的淋巴细胞亚群的VH或VL链的组库，或替代地，TCRα和β的组库，或更一般地说，以研究适应性免疫系统的功能(Wu等,2011)。免疫学研究人员对一次高通量分析多转录物具有尤其大的需求。

目前可获得的用于免疫组库测序的方法涉及从所关注的细胞群体，例如骨髓的记忆B细胞或浆细胞，分离出mRNA，然后大批进行RT-PCR以合成用于高通量DNA测序的cDNA(Reddy等,2010；Krause等,2011)。但是，重抗体链和轻抗体链(或α和βT细胞受体)在分开的mRNA链上编码并且必须分开测序。因此，这些可获得的方法具有单独地揭开全部重链免疫组库和轻链免疫组库的可能，但还不能解决以高通量的重链和轻链配对。在不以单细胞水平的多转录物分析以收集重链和轻链配对数据的情况下，包括两条链的全适应性免疫受体不能测序或重建并且表达用于进一步研究。

发明概述

在第一实施方案中，本发明提供一种方法，所述方法包括(a)将单细胞和mRNA捕获剂隔离到单独隔室中；(b)使细胞裂解并且收集具有mRNA捕获剂的mRNA转录物；(c)使用mRNA捕获剂从隔室分离mRNA；(d)进行逆转录，然后对捕获的mRNA进行PCR扩增；以及(e)测序从单细胞扩增的至少两个不同cDNA产物。在某些方面中，细胞可为B细胞(例如，浆细胞或记忆B细胞)、T细胞、NKT细胞和癌细胞。

因此，在特定实施方案中，本发明提供一种用于获得多个成对抗原受体序列的方法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸将单哺乳动物细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使细胞裂解并且允许mRNA转录物与固定化寡核苷酸缔合；(c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单细胞的mRNA转录物的cDNA；(d)测序cDNA；以及(e)基于测序鉴别多个单细胞的多mRNA转录物(例如成对抗原受体序列)。例如，在一些方面中，提供一种用于获得多个成对抗体VH和VL序列的方法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸将单B细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使B细胞裂解并且允许mRNA转录物与固定化寡核苷酸缔合；(c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单B细胞的mRNA转录物的cDNA；(d)测序cDNA；以及(e)鉴别多个单B细胞的成对抗体VH和VL序列。在另外方面中，提供一种用于获得多个成对T细胞受体序列的方法，所述方法包括(a)用固定化寡核苷酸将单T细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使T细胞裂解并且允许mRNA转录物与固定化寡核苷酸缔合；(c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单T细胞的mRNA转录物的cDNA；(d)测序cDNA；以及(e)基于测序鉴别多个单T细胞的成对T细胞受体序列。

在另外方面中，所述方法包括获得至少10,000个、100,000个或1,000,000个单个细胞(例如，在约100,000个与一千万个或一亿个之间的单个细胞)的序列。因此，在一些方面中，所述方法包括获得至少5,000个、10,000个或100,000个个体成对抗体VH和VL序列(例如，在约10,000个与100,000个、一百万个或一千万个之间的个体成对序列)。在某一方面中，获得如VH和VL序列的成对序列可包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应来连接cDNA(例如，VH和VL cDNA)以连接单分子中的cDNA。在替代方面中，实施方案的方法不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应。例如，两个(或更多个)cDNA序列可通过测序不同分子，如通过测序不同分开的VH和VL cDNA分子获得。