[发明专利]单细胞的多转录物的高通量测序

权利要求书

1.一种获得成对TCR序列或成对抗体VH和VL序列的方法，其包括：

a)将单细胞和mRNA捕获剂隔离到单独隔室中，其中所述单独隔室为乳液中的微泡；

b)裂解所述细胞并且用所述mRNA捕获剂收集mRNA转录物；

c)使用所述mRNA捕获剂从所述隔室分离所述mRNA；

d)进行逆转录，接着对所述捕获的mRNA进行PCR扩增；以及

e)测序从单细胞扩增的至少两个不同cDNA产物；

其中所述细胞为T细胞或B细胞；

所述mRNA捕获剂为珠粒且所述珠粒包括杂交mRNA的寡核苷酸；并且

所述至少两个不同cDNA产物提供成对TCR序列或成对抗体VH和VL序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述珠粒为磁性的。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸包括poly(T)和对所关注的转录物特异的引物中的至少一者。

4.如权利要求1所述的方法，其进一步定义为获得结合到所关注抗原的抗体的成对抗体VH和VL序列的方法。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述珠粒缀合到所关注抗原，并且所述寡核苷酸在结合到所关注抗原的抗体的存在下仅缀合到所述珠粒。

6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。

7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)和(b)包括将单细胞和mRNA捕获剂分离到乳液中并且存在细胞裂解溶液的单独微泡中。

8.如权利要求1所述的方法，其包括从至少10,000个单个细胞获得序列。

9.如权利要求1所述的方法，其包括获得至少5,000个单独成对抗体VH和VL序列。

10.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应连接cDNA以将至少2个转录物连接到单DNA分子中。

11.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应。

12.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应连接VH和VL cDNA以将VH和VLcDNA连接到单分子中。

13.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应并且其中所述VH和VL cDNA为分开的分子。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述VH和VL序列通过测序不同分子获得。

15.如权利要求1所述的方法，其还包括鉴别所述成对抗体VH和VL序列包括进行所述序列的概率分析。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述概率分析是基于所述CDR-H3或CDR-L3序列。

17.如权利要求15所述的方法，其中鉴别所述成对抗体VH和VL序列包括比较原始测序读长计数。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述概率分析包括进行如下的步骤

a)开始；

b)在数据组中找到所有独特的VH；在数据组中找到所有独特的VL；

c)对于每一VH_i:t_VL(VH_i)找到排序在前的VL；对于每一VL_j:t_VH(VLj)找到排序在前的VH；

d)选择VH_i；

e)评估VH_i＝t_VH[t_VL(VH_i)]；如果为真，则示出一致打印VH:VL对；如果为假，则判断为矛盾的VH:VL对；

f)如果已经评估所有的VH_i，则结束；如果尚未评估所有的VH_i，则选择新的VH_i，重新进行步骤e)。

19.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括通过进行重组连接cDNA。