[发明专利]作为雌性不育的治疗靶标和诊断标记的无细胞DNA

说明书

本发明涉及雌性不育领域。更精确地，其涉及一种雌性不育的新标记，以及增加有此需要的雌性患者的孕育能力的新型治疗。

在最近几年里，作者已经报道了无法解释的不育的流行程度高达20％至25％。不育是指夫妻在尝试孕育持续至少一整年后仍然不能怀孕。

不育的诊断以考虑病史和体检开始。如果检查局限于经过一年的尝试未能怀孕的任何夫妻中的卵巢功能评价、子宫输卵管造影片和腹腔镜检查，那么大量的不育病例是无法解释的。通过增加大量的测定(测量多种激素和细胞因子的水平，检测与雌性不育相关的基因中的任意突变的基因检验技术)扩大诊断检测仅仅略微减少“无法解释的”不育。

吸烟、过量咖啡因摄入或饮酒的有害影响是已知的。然而，它们对不育的影响因个体而大大不同，并且目前还没有生物学标志能够定量这种影响。因此，通过目前可用的检测并不能精确地评估这些影响。

在临床不育的治疗中，辅助性的繁殖技术(ART)具有最高的活产率/治疗。ART自其开始已经在世界范围内有助于超过一百万婴儿的孕育。然而，这些技术的失败率仍然是显著的，并且在一次尝试失败后，由于治疗的身体、精神和经济成本，夫妻对于继续ART或重复ART治疗的决定通常是一个艰难的决定。

体外受精(IVF)和精子卵浆内注射技术(ICSI)数据清楚表明，甚至在最成功的程序中，相对于转运的胚胎数的低植入率。导致植入问题的缺陷可能比目前所评价的要常见得多，并且构成另一个无法解释的不育领域。

测定植入因子，如整联蛋白、LIF、G-CSF或其他生长因子，可能导致对其他不育病例的理解，并且因此降低被归类为患有“无法解释的不育”的患者的百分数，但是，在大部分病例中，这在关于治疗的最初的审慎考虑中并没有帮助。在法国，关于每次卵母细胞抽取(oocyte retrieval)的活产，ART的成功率为25％-28％。

从上文可以看出，似乎雌性不育所涉及的多种参数完全被目前的检测忽视了。

1948年，Mendel和Metais报道了在人血浆中存在循环的无细胞DNA(circulating cell-free DNA)[1]。无细胞循环DNA(cfDNA)已经在宽泛的生理和病理学病症中进行研究，所述病症包括炎性紊乱、氧化应激和恶性病。其在健康受试者中以0-100ng/ml的血液浓度存在，平均为30ng/ml[2]。假定正常细胞的DNA含量总计为6.6pg，这些数值代表平均0–15,000个基因组当量/ml血液，平均为5000个基因组/ml。这种DNA的大部分是双链的，并且外观上以核蛋白复合物的形式存在。

cfDNA在低百分数琼脂糖凝胶上的电泳已经显示出0.18-21kb的DNA片段的尺寸的变化，在DNA片段的尺寸分布上随样品而变化。检测大的、准基因组(quasi-genome)尺寸的DNA片段是常见的。

尽管与游离DNA释放到血流中相关的精确机制尚是不确定的，但是其可能来源于凋亡、坏死和从细胞的主动释放的组合。

cfDNA从血流中的清除是快速发生的：胎儿DNA在分娩后以16.3分钟的半衰期从母亲血液中消失[3]。已知cfDNA对血浆核酸酶(例如，DNA酶I)敏感，但是肾[4]和肝[5]清除机制也参与了cfDNA的消除。

迄今为止，cfDNA的释放是否具有任何生物学作用还是未知的。培养的细胞已经表现出向培养基中释放双链DNA[6]，并且cfDNA可能结合在细胞中[7]。这些发现导致引入“基因组转移(genometastasis)”的概念[8]。然而，这种假说有待证明。

循环DNA可以从血浆和血清两者中分离，但是血清中含有约6倍高浓度的循环DNA。近来，Umetani等表明所述6倍高的血清DNA水平中少于10％是由于被其他来源的污染所导致的(即，在血清分离期间从白细胞释放的)[9]。关于高血清水平的原因是未知的，但是排除在纯化步骤期间血浆中DNA的损失[9]。

无细胞循环DNA是潜在有用的生物标记。DNA水平和断裂模式为诊断和预后目的提供有意义的可能性。近来，Bartoov等记述了用于评估男性受试者的孕育状态的方法，所述方法是基于来自所述受试者的流体样品中的cfDNA的测量(WO2008/047364)。他们还提议了通过向低生育力的男性施用DNA酶来治疗男性低生育能力的方法。无细胞DNA还被提议为用于非侵入性监测恶性和良性增生和炎性病症(如子宫内膜异位症(endometriosis))的生物标志[10]。